[发明专利]黄芪多糖在环介导等温扩增中的应用及其试剂盒和检测方法

权利要求书

1.黄芪多糖在环介导等温扩增中降低聚合酶使用量或/和缩短反应时间中的应用。

2.含有黄芪多糖的环介导等温扩增的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：环介导等温扩增内引物和外引物，嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱、黄芪多糖和荧光染料赛博绿Ⅰ；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为150-250mmol/L、pH为8.5-8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为50-100mmol/L的氯化钾、浓度为50-100mmol/L的硫酸铵、浓度为15-20mmol/L的硫酸镁和质量分数为0.5-1％的曲拉通X-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成；所述环介导等温扩增内引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增内引物浓度分别为5μmol/L；所述外引物浓度分别为20μmol/L。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶浓度为4U/μl、所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物各组分浓度为10mmol/L、硫酸镁浓度为100mmol/L、甜菜碱浓度为2mol/L、黄芪多糖浓度为4mol/L和荧光染料赛博绿Ⅰ质量分数为10％。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/L、pH为8.8的Tris–HCl、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的Triton X-100组成。

6.权利要求2～5任一项所述的试剂盒在基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中的应用。

7.基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μl；

b、鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的环介导等温扩增：在反应管中配制环介导等温扩增反应体系，各组分终浓度如下：浓度各为0.1-0.2μmol/L的内引物，浓度各为0.5-0.8μmol/L的外引物，3～4U嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为0.5-1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为2-3mmol/L的硫酸镁，浓度为0.5-1mol/L的甜菜碱，浓度为0.1～0.5mol/L的黄芪多糖，待检模板DNA水溶液0.5-1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应20～30分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；所述内引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿Ⅰ水溶液0.5-1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌。