[发明专利]检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，还涉及利用该试剂盒检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的方法。

背景技术

目前，原微生物的检测方法主要有分离培养鉴定法、聚合酶链式反应(PCR)法和荧光定量PCR(FQ-PCR)法，但分离培养鉴定法操作繁琐、费时，PCR法和FQ-PCR法需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，不适合中小型单位和现场检测应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与其它核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，成本低，已在病原微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但扩增过程中仍需要价格较高的DNA聚合酶，如果能减少DNA聚合酶的使用量将对进一步降低病原微生物检测成本具有重要意义。

克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(k.rhinoscleromatis)。其中臭鼻克雷伯氏菌对家禽致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。由其引起的鸡鼻炎型克雷伯氏菌病是危害鸡、火鸡和山鸡等家禽和野禽的一种接触性传染病。该病发病率和死亡率通常在10～30％，但有的鸡场感染鸡鼻炎型克雷伯氏菌的病鸡死亡率高达75％。一旦某地区的鸡群发生鸡鼻炎型克雷伯氏菌感染，该病就会成为地方性疾病，很难彻底根除，并且经常反复爆发，带来巨大的经济损失。鸡鼻炎型克雷伯氏菌感染以引起慢性萎缩性鼻炎，有恶臭，以及败血症、泌尿系感染等为主要病理特征，在病理学上很难与副鸡嗜血杆菌性鼻炎感染进行区别。因此有必要建立一种低成本的检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌病的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒灵敏度高，特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位和现场检测应用；本发明的目的之二在于提供利用所述试剂盒检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下检测方案：

1、检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，包括如下组分：环介导等温扩增内引物和外引物，嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱、右旋糖苷、黄芪多糖和荧光染料赛博绿Ⅰ；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为150-250mmol/L、pH为8.5-8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为50-100mmol/L的氯化钾、浓度为50-100mmol/L的硫酸铵、浓度为15-20mmol/L的硫酸镁和质量分数为0.5-1％的曲拉通X-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成；所述环介导等温扩增内引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述环介导等温扩增内引物浓度分别为5μmol/L；所述外引物浓度分别为20μmol/L。

优选的，所述嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶浓度为8U/μl、所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物各组分浓度为10mmol/L、硫酸镁浓度为100mmol/L、甜菜碱浓度为2mol/L、右旋糖苷浓度为4mol/L，黄芪多糖浓度为4mol/L和荧光染料赛博绿Ⅰ质量分数为10％。

优选的，所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/L、pH为8.8的Tris–HCl、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的Triton X-100组成。

2、利用所述试剂盒检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的方法，包括以下步骤：

a、提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μl；