[发明专利]一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株及其在防治鸡大肠杆菌病中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途，特别涉及一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗株、其制备方法以及在防治鸡大肠杆菌病中的用途，本发明属于医药技术领域。

背景技术

禽大肠杆菌病(avian colibacillosios)是由禽致病性大肠埃希氏菌(APEC)感染禽类引起的多种临床病型的总称，主要表现有胚胎和幼雏的死亡、败血症、气囊炎、心包炎、输卵管炎、肠炎、腹膜炎和大肠杆菌性肉芽肿等。病原性大肠埃希氏菌血清型众多，抗原结构复杂，药物防治是治疗该病的重要措施，但流行株广泛存在耐药性，为该病的防控带来困难。

目前预防禽大肠杆菌病的疫苗产品有混合多种血清型大肠杆菌的甲醛灭活铝胶疫苗、甲醛灭活油乳剂疫苗、蜂胶灭活苗，菌毛油乳剂甲醛灭活苗等，以铝胶疫苗和油乳剂疫苗为主。虽取得一定的免疫效果，但免疫注射后易在注射部位形成结节、吸收不彻底，对免疫鸡群应激反应大，影响肉质及生长，同时从食品安全卫生角度来看，油佐剂在动物体内的残留会对食品安全造成潜在影响。此外，治疗大肠杆菌感染还常使用各种抗菌药物，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环，同时也加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，影响食品安全。

禽大肠杆菌病主要是由大肠杆菌污染饲料、饮水、用具及环境后，病原菌通过鸡的呼吸道、消化道和种蛋等途径进行传播。基于大肠杆菌可经肠道黏膜感染而致病的特点，结合具有免疫原性的致病因子来研制口服疫苗，是科学防治禽大肠杆菌病的理想途径。

乳酸菌是一种食品级微生物，利用乳酸菌作为疫苗抗原传递载体逐渐获得了研究者认可，并成为该领域的研究热点。乳酸菌黏膜免疫制剂在禽类研究及应用上的前景广阔，顺应了当前养殖业注重绿色、安全和环保的理念。益生菌乳酸菌具有耐受消化道环境胁迫能力、肠道定殖能力、维护肠道微生态平衡、免疫佐剂等特性，是研制预防禽大肠杆菌病口服黏膜免疫疫苗的理想活菌载体。

本发明根据致病性大肠杆菌主要经动物肠道致病的特点，以禽致病性大肠杆菌黏附素和外膜蛋白为免疫原，利用乳酸菌作为免疫抗原传递载体，从黏膜免疫角度设计疫苗以预防该病，对防控鸡大肠杆菌病具有重要意义，也是本发明主要解决的技术问题。黏附素是禽致病性大肠杆菌的重要致病因子，其中Ⅰ型菌毛普遍存在于禽致病性大肠杆菌，在感染过程中发挥重要作用；外膜蛋白(OMPs)是革兰氏阴性菌细胞壁的特有结构，也是一种致病因子，具有较强的免疫原性，可加快巨噬细胞对抗原的摄取，刺激机体的体液免疫，同时对细胞免疫有刺激作用，并可抵抗同源和异源菌的攻击。微褶皱细胞(M细胞)作为抗原转运细胞，树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞，在黏膜免疫中起到至关重要的作用，研究表明M细胞靶向肽和DC靶向肽能显著提高黏膜免疫制剂的免疫效率。基于上述问题的考虑，本发明以禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白FimA和外膜蛋白C(ompC)为免疫原，并融合M细胞靶向肽(Co1)和DC靶向肽(DCpep)，利用鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneri M-11为疫苗抗原传递载体，构建靶向给药预防鸡大肠杆菌病的基因工程乳酸菌亚单位口服疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株、其制备方法以及在防治鸡大肠杆菌病中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株，所述的疫苗株是通过将表达鸡致病性大肠杆菌ompC蛋白和fimA蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌中得到的，ompC蛋白和fimA蛋白之间通过柔性序列连接，所述的融合蛋白的连接顺序为ompC-fimA-M细胞靶向肽-DC细胞靶向肽。

其中，优选的，所述的乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌。

其中，优选的，所述的鸡肠道源乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneri M-11。

其中，优选的，所述的表达载体通过以下步骤制备得到：

(1)以鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR分别获得去除信号肽后的fimA及ompC基因；