[发明专利]一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株及其在防治鸡大肠杆菌病中的用途

权利要求书

1.一种靶向传递疫苗抗原的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将表达鸡致病性大肠杆菌ompC蛋白和fimA蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体转入乳酸菌中得到的，其中ompC蛋白和fimA蛋白之间通过柔性序列连接，所述的融合蛋白的连接顺序为ompC-fimA-M细胞靶向肽-DC细胞靶向肽。

2.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌，优选的，所述的鸡肠道源乳酸菌为鸡肠道源乳酸菌Lactobacillus saerimneri M-11。

3.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的表达载体通过以下步骤制备得到：

(1)以鸡大肠杆菌CVCC1553基因组DNA为模板，采用PCR分别获得去除信号肽后的fimA及ompC基因；

(2)将M细胞靶向肽(Co1)和DC细胞靶向肽(DCpep)编码基因通过融合PCR方法构建到fimA基因的下游，得到融合基因fimA-Co1-DCpep，然后将ompC基因和fimA-Col-DCpep融合基因依次连入pMD18-T载体中的SacI和ApaI酶切位点之间，fimA-Col-DCpep融合基因与ompC基因通过柔性序列连接，得到的重组载体命名为pMD18-ompC-fimA-Co1-DCpep；

(3)乳酸菌组成型表达质粒pPG-T7g10-PPT的构建

在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，与HCE-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了组成型分泌表达乳酸菌载体，命名为pPG-T7g10-PPT，其中HCE为芽孢杆菌组成型分泌表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)利用限制性核酸内切酶Sac I和Apa I对质粒pMD18-ompC-fimA Co1-DCpep和乳酸菌表达质粒pPG-T7g10-PPT进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的ompC-fimA-Co1-DCpep基因片段与表达载体pPG-T7g10-PPT目的片段连接，构建重组表达质粒，即为所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体，命名为pPG-T7g10-PPT-ompC-fimA-Co1-DCpep，简称pPG-OF-Co1-DCpep。

4.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，所述的表达鸡致病性大肠杆菌fimA和ompC蛋白以及靶向M细胞和DC细胞的靶向肽的融合蛋白的表达载体通过电转化方法转入乳酸菌的感受态细胞中。

5.如权利要求1所述的基因工程乳酸菌口服疫苗株，其特征在于，步骤(1)中ompC基因和fimA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11以及12所示，柔性序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述DC细胞靶向肽(DCpep)及M细胞靶向肽(Col)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14以及15所示。