[发明专利]一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法

说明书

本发明属于瓜类枯萎病防治技术领域，公开了一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法，包括：异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；宏基因组Fosmid文库构建及其质量检测；筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；活性物质的提纯和鉴定，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；筛选和改造植物内生菌株，将基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。本发明将分离、筛选和改造植株内生菌作为表达株系，建立从文库中筛选出来的有生物学活性的目的基因异源高效表达体系。为实现抗枯萎病药物的商品化奠定坚实的基础。

技术领域

本发明属于瓜类枯萎病防治技术领域，尤其涉及一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法。

背景技术

瓜类枯萎病又称蔓割病、萎凋病，是瓜类生产中主要的土传病害之一，尤以西瓜、黄瓜和甜瓜上的危害最为严重。该病遍及中国、美国、意大利、以色列、日本和印度等几十个国家和地区，我国南北方西瓜种植区都有不同程度发生。尤其是南方热带和亚热带地区，雨量充沛、气候温和，病原菌无越冬现象，造成病菌孢子在土壤中的大量累积，病害发生率极高，重茬地一般发病率在30％以上，严重地块达80％，甚至造成绝产。近些年来瓜类枯萎病害频频发生，并有蔓延趋势，严重影响了瓜类产量和品质，使农民遭受巨大的经济损失。瓜类枯萎病的防治方法主要有农业防治(嫁接和培育抗病品种等)、物理防治、化学防治、生物防治等，目前多以化学药剂防治为主。但由于土传病害中的病原菌掩蔽性较强，化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高。同时化学药剂广泛使用所带来的环境污染等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制。因此，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已显得十分重要和迫切。在瓜类枯萎病的生物防治研究中，生防资源虽然丰富，人们也通过室内生物测定的方法，筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌(木霉属真菌)、细菌(假单胞菌等)和放线菌，但是，其温室和大田防治效果不明显，甚至无效果，不能开发成商品化的生物防治药剂应用于大田实际生产中。究其因，生防菌株不能在根围，甚至维管束部定植，而瓜类枯萎病是一类维管束寄生菌，在适宜的温、湿度下萌发出芽管，从根部、根尖或伤口侵入，进入维管束后阻塞导管，病菌产生大量菌丝和菌核，影响导管对水分和养分的运输，病菌分泌果胶酶和纤维素酶分解破坏细胞，使有毒物质堵塞导管，从而造成维管束变褐，植株萎焉。一旦枯萎病菌能够跨越传播、吸附、侵入的屏障，它将在维管束内大量繁殖，堵塞导管。因此，根据病菌的侵染特点，以植株内生菌作为表达株系，筛选和改造内生菌株，建立抗枯萎病天然活性产物的异源高效表达体系，是实现瓜类枯萎病生物防治的关键，其研究成果对于枯萎病的有效防控将做出重要的贡献。另外，筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。然而，环境中只有不到1％的微生物是可用实验室传统纯培养的方法获得，99％以上的微生物是不可纯培养的。1克土壤可能包含多于4000种微生物(估计微生物细胞数高达100亿以上)。土壤微生物种类极其繁多，代谢形式也呈现多样化，其代谢物的化学复杂性和多样性，是筛选抗生素与药物先导化合物的极具潜力的资源库，许多具有独特结构和良好生物活性的微生物代谢产物被相继发现和开发利用，如用于癌症化疗的药物阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、道诺霉素(daunorubicin)和丝裂霉素(mitomycin)等。近10年来，尽管科学家们努力改进筛选方法和测试病原微生物种类，但是基于微生物纯培养技术发现新抗生素药物的成功几率越来越小(如从40，000微生物中仅筛选到3个可用的新抗生素)，且往往会出现重复筛选的现象。如何挖掘这个巨大的天然宝藏并服务于人类，已成为科学家们的共同目标。首次提出“宏基因组(Metagenome)”的概念，并定义为“the genomes of the totalmicrobiota found in nature”，即某一生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的原核生物(细菌、古菌)和真菌的基因组总和。宏基因组文库技术避开了微生物分离培养的问题，既能得到可培养微生物基因，也能得到未培养微生物的基因，为微生物资源利用开辟了一个新的途径。这种寻找新的功能基因或者功能基因簇的策略，对研发新药物、生物农药和工业用酶等诸多生物活性物质开发提供了广阔的前景。随着分子生物学技术在环境微生物生态学中广泛应用，近年来宏基因组研究已成国际上新的研究热点和前沿领域，在欧美等发达国家得到了广泛的重视和快速发展。采用宏基因组克隆技术从以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到抗菌活性的五种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E。德国哥廷根大学的Daniel Rolf实验室从土壤样品直接提取DNA，利用表达载体pSK+转化到大肠杆菌中成功构建了宏基因组文库，用42羟基丁酸作唯一的碳源和能源筛选到了5个能够稳定利用42羟基丁酸的克隆，随后的研究中先后获得了新的生物素合成操纵子、琼脂糖酶、乙醇脱氢酶、甘油脱水酶等。由于细菌合成某些活性物质的基因经常以基因簇的形式出现，利用细菌人工染色体载体pBeloBACⅡ构建了两个土壤样品的宏基因组BAC文库，筛选出了1个有抗菌活性、2个分泌酯酶、8个分泌淀粉酶、29个有溶血活性的克隆，随后对1个棕色重组克隆进行了亚克隆研究，获得了2个具有广谱抗菌作用的新抗生素TurbomycinA和B及其合成酶基因簇。通过构建fosmid文库筛选到了一批脂肪酶新型基因，DNA数据揭示他们获得的酶基因和数据库中已知的脂肪酶基因氨基酸序列有45％左右的同源性。但是仅仅限于DNA数据分析，他们没有做酶的表达。构建了土壤eDNA的穿梭粘粒载体文库，从中发现了11个抗肿瘤活性物质新的聚酮合成酶I(PKS I)的基因簇。同时，用不同宿主做了比较实验，发现采用多种不同的宿主可以提高外源基因表达生产不同活性物质的几率。此外，采用人唾液、采用海水构建宏基因组文库分别筛选到了新的几丁质酶和四环素抗性基因等。宏基因组学研究作为一项刚刚起步不久的新技术，其摆脱了传统微生物分离培养的方法，直接获取微生物功能基因，为最大限度的开发利用丰富的未培养微生物资源提供了一个广阔的平台。目前，宏基因组学的研究在美国、德国、法国和韩国等发达国家发展迅速，国内鲜见类似报道。迄今为止，国内外已报道的瓜类枯萎病菌尖孢镰刀菌有7个专化型，即西瓜、甜瓜、丝瓜、葫芦、黄瓜、苦瓜和冬瓜专化型，而以西瓜、黄瓜的危害最为严重。因此，以西瓜枯萎病为研究对象，依托海南岛热带雨林土壤蕴藏的丰富微生物基因资源，利用宏基因组技术从土壤未培养微生物群落中挖掘新的抗瓜类枯萎病基因资源及其异源活性产物的高效表达，并探索开发新的抗瓜类枯萎病药物，为瓜类枯萎病的生物防治研究提供新的技术手段，具有十分重要的科学价值和现实意义。