[发明专利]异位表达的载体及其在提高植物营养组织油含量的应用

权利要求书

1.在植物营养组织中异位表达的载体，其特征在于：所述载体引入以下模块：

调控油脂合成的四种目的基因LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1中的至少三种；

控制目的基因均衡表达的转录单元；

多克隆位点。

2.如权利要求1所述的在植物组织中异位表达的载体，其特征在于：所述载体为含有LEC2、DGAT1、OLEO2和GAT1基因组合的载体。

3.如权利要求1或2所述的在植物营养组织中异位表达的载体，其特征在于：所述载体中启动LEC2基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS；启动DGAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为At4g25710 基因的3’UTR；启动OLEO2基因表达的启动子为At4g25700基因的启动子，终止该基因表达的终止子为NOS；启动GAT1基因表达的启动子为35S，终止该基因表达的终止子为NOS。

4.如权利要求3所述的在植物营养组织中异位表达的载体，其特征在于：所述载体是以pBI121双元载体为骨架构建的。

5.如权利要求2所述的在植物营养组织中异位表达的载体，其特征在于：构建所述载体的方法，包括以下步骤：

a、选择pBI121双元载体为构建骨架；在35S的5’端引入包括BamHI，XmaI，SmaI，XhoI和SacI的多克隆位点后将其插入pBI121中获得pBI121-35S；

b、扩增35S-NOS DNA片段；然后在35S-NOS DNA片段的5’端加入KpnI-ClaI-StuI多酶切位点，3’端加入HindIII-ClaI-EcoRI多酶切位点，再通过KpnI和EcoRI将35S-NOS DNA片段克隆到载体pYES2中，获得中间载体pYES2-35S-NOS；

c、以拟南芥基因组DNA为模板，扩增含有At4g25710 基因的3’UTR和At4g25700 基因的启动子（BCH1）及5’UTR的DNA片段，再在该DNA片段的5’端加入BamHI酶切位点，3’端加入SacI酶切位点，然后通过BamHI和SacI将该DNA片段插入到载体pYES2-35S-NOS中，获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS；

d、以拟南芥的cDNA为模板，扩增OLEO2目的基因，然后在OLEO2目的基因的5’末端和3’末端均加上SacI单酶切位点，再通过单酶切位点SacI将OLEO2目的基因克隆到载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS，获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR- OLEO2-NOS；

e、以拟南芥的cDNA为模板，扩增DGAT1目的基因，然后在DGAT1目的基因的5’末端和3’末端均加上BamHI单酶切位点，再通过单酶切位点BamHI将DGAT1目的基因克隆到载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS，获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-DGAT1-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS，即pYES2-DGAT1-OLEO2；

f、以酵母基因组为模板，扩增GAT1目的基因，在GAT1目的基因的5’端引入酶切位点BamHI，3’端引入酶切位点XhoI，通过BamHI和XhoI将GAT1目的基因克隆到载体pBI121-35S，构成单基因表达载体pBI121-35S-GAT1；然后将中间载体pYES2-DGAT1-OLEO2中的基因片段DGAT1-OLEO2通过ClaI位点克隆到载体pBI121-35S-GAT1，获得三基因植物表达载体pBI121-DGAT1-OLEO2-GAT1；

g、以拟南芥的cDNA为模板，扩增LEC2目的基因，再在其3’端引入XbaI、5’端引入SacI，然后将LEC2目的基因克隆到pBI121-35S，构成单基因表达载体pBI121-LEC2；在扩增的LEC2目的基因的5’末端和3’末端均加上StuI单酶切位点，再通过单酶切位点StuI将LEC2目的基因克隆到三基因植物表达载体pBI121-DGAT1-OLEO2-GAT1，获得四基因表达载体pBI121-LEC2-DGAT1-OLEO2-GAT1。