[发明专利]一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物、试剂盒和方法有效
| 申请号： | 201710732983.1 | 申请日： | 2017-08-23 |
| 公开（公告）号： | CN107723354B | 公开（公告）日： | 2021-09-07 |
| 发明（设计）人： | 林钊;张燕菲;张纪斌;何广良;周艳河;何铭辉 | 申请（专利权）人： | 广州永诺健康科技有限公司;广州永诺医学检验所有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 宋静娜;郝传鑫 |
| 地址： | 510000 广东省广州市*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 通量 检测 细胞 肺癌 致癌 基因突变 多重 pcr 引物 试剂盒 方法 | ||
1.一种基于高通量测序构建非小细胞肺癌致癌基因文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）第一轮PCR扩增：以待检样本的基因组DNA为模板，用扩增引物混合液 R1-barcode、R2-barcode 分别进行 PCR 扩增，获得第一轮PCR产物，所述R1- barcode包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:98所示的引物，所述R2-barcode包括SEQ ID NO:99～SEQ ID NO:196所示的引物；序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO: 196所示的引物为带barcode序列的下游引物；所述引物的5’端具有接头序列，所述引物的3’端具有特异性引物序列；所述barcode序列位于所述接头序列和所述特异性引物序列之间，所述barcode序列是序列长度为10bp的DNA序列；
（2）第二轮PCR扩增：将步骤（1）中由R1-barcode扩增获得的PCR产物用扩增引物混合液F1-non barcode以及通用的下游引物进行PCR扩增，将步骤（1）中由R2-barcode扩增获得的PCR产物用扩增引物混合液F2-non barcode以及通用的下游引物进行PCR扩增，所述F1-nonbarcode包括SEQ ID NO:197～SEQ ID NO:294所示的引物，所述F2-non barcode包括SEQID NO:295～SEQ ID NO:392所示的引物，所述通用的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:393所示；序列如SEQ ID NO:197～SEQ ID NO: 392所示的引物为不带barcode的上游引物；
（3）第三轮PCR扩增：将步骤（2）获得的PCR 产物混合后纯化，再用接头引物进行第三轮PCR扩增，得到测序文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中接头引物为用于Illumina测序仪测序文库构建的接头引物。
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