[发明专利]一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因作物鉴定技术领域，具体涉及一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，为全球人口提供了丰富的蛋白质和能量，也是我国第二大粮食作物。随着人口的增加，未来全球对小麦的需求将呈大幅度增长的趋势。因为基因的限制，小麦产量的增长是有限制的，不能通过传统的栽培技术来满足需求。转基因技术可能成为缓解粮食安全问题的重要手段。为了满足需求，需要通过基因工程的手段培育转基因植物。转基因技术是一种发展蓬勃的手段，能够帮助培养出具有理想性状的植株，具有巨大潜力。由于转基因技术中目的基因插入的随机性和插入位点基因表达的盲目性，转基因作物的安全性引起了公众的广泛关注；且小麦等禾谷类作物基因转化效率极低，而寻找一种有效的鉴别转基因小麦的方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法。本发明提供的鉴定方法假阳性出现概率低，且能够精确地定位外源基因的插入位置，本发明提供的方法对于后期转基因植株功能的研究具有深远的意义，为创育小麦新种质资源奠定了基础。

本发明提供了一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法，包括以下步骤：

1)以农杆菌介导法转化后的小麦为材料提取小麦基因组；

2)依据Genome-walking的原理，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列，设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3；

3)以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段；

4)将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。

优选的是，采用小麦叶片进行基因组的提取。

优选的是，所述染色体步移试剂盒为宝生物公司出售的染色体步移试剂盒；

所述染色体步移试剂盒包括以下组分：兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4、对照模板、TaKaRa LATaq、10×LAPCR Buffer II(Mg²⁺plus)、dNTP Mixture、6×Loading Buffer。

优选的是，所述步骤2)中3条特异性引物的Tm值独立地为50～60℃。

优选的是，所述转化用载体为pDTAAS。

优选的是，当转化用载体为pDTAAS时，所述步骤2)设计得到的引物SP1的序列如SEQ ID NO.1所示，SP2的序列如SEQ ID NO.2所示，SP3的序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的是，所述步骤4)中进行数据比对前还包括：将所述扩增片段中与转化用载体互补的基因片断去除。

本发明提供了一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法。采用染色体步移技术，同时与生物信息学分析相结合，能够在小麦基因组测序序列中精确地定位外源基因的插入位置，将插入位点精确到某个染色体的某个位点，筛选出外源基因插入小麦基因间或着丝粒区域的转基因材料，可防止外源基因对小麦基因组的干扰，且本发明鉴定方法假阳性出现概率低，对于后期转基因植株功能的研究具有深远的意义，为创育小麦新种质资源奠定了基础。

附图说明

图1为本发明中pDTAAS表达载体图谱以及特异引物设计位置；

图2为本发明实施例1提供的结合染色体步移试剂盒进行热不对称交错PCR得到的扩增序列条带；

图3为本发明实施例1提供的样品15外源基因插入位点鉴定结果图；

图4为本发明实施例1提供的样品21外源基因插入位点鉴定结果图；

图5为本发明实施例1提供的样品29外源基因插入位点鉴定结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种小麦外源基因插入位点的鉴定方法，包括以下步骤：

1)以农杆菌介导法转化后的小麦为材料提取小麦基因组；

2)依据Genome-walking的原理，基于步骤1)转化用载体的T-DNA序列，设计3条嵌套的特异引物SP1、SP2和SP3；

3)以步骤2)得到的特异性引物SP1、SP2和SP3与染色体步移试剂盒结合进行热不对称交错PCR反应，得到扩增片段；

4)将步骤3)得到的扩增片段与国际小麦基因组测序联合会小麦基因组数据进行比对，得出外源基因在小麦中的插入位点。