[发明专利]一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法

权利要求书

1.一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法，其特征在于，按照下列步骤操作：

a、培育不同种质的烟苗；

b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；

c、将收集好的根系分泌物浸提液定容至200 mL，然后取根系分泌物浸提液和乙酸乙酯各100 mL混入分液漏斗中萃取，合并萃取液；

d、取萃取液有机相用旋转蒸发仪在40℃水浴下旋蒸浓缩至浸膏，随后用去离子水洗瓶定容至1 mL，无水硫酸钠除水，装入1.5 mL样品瓶中，获得根系分泌物萃取液，并用0.22 µm微孔膜过滤；

e、将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；

f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，于28℃恒温培养箱黑暗培养；

g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；

h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质；

步骤e将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；马铃薯培养基制备具体为：马铃薯葡萄糖琼脂40.1 g ，加入到1000 mL蒸馏水中煮沸3 min左右，定容至1000 mL，121℃灭菌20 min；步骤f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，进一步包括培养黑胫病菌菌饼的获得：于马铃薯培养基上培养黑胫病菌，待病菌接近长满培养皿时，在菌落的边缘取直径0.5 cm的烟草黑胫病菌菌饼用于步骤f接种；步骤g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；共测量4次；

本方法需时：2个月，费用：0.6万元，准确率：98%以上，不易污染，不用地，实验室中完成。