[发明专利]一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还提供了一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA方法，本发明的检测方法不仅易于操作，对设备要求低，而且特异性强，灵敏度高，结果准确可靠，为有效检测和诊断鸡传染性喉气管炎提供了一种成本低、快速、特异的现场诊断方法。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物及其检测方法。

背景技术

鸡传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒(Infectious LaryngotracheitisVirus，ILTV)引起的一种急性、接触性上部呼吸道传染病。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展，只有对该疫病进行快速的现场诊断，才能为疫病的有效防控争取宝贵时间，最大限度地减少损失和疫病的进一步传播。

常规的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术以其能够检测痕量的病原DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但PCR需要特殊的热循环设备、低温保存的试剂和避免交叉污染的技术操作要求，从而限制了PCR在现场诊断中的应用。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶(Polymerase)。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃-42℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于现场诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA技术具有不同于常规PCR的诸多优点：1)RPA反应在常温下即可进行；2)RPA检测的灵敏度很高；3)既可用于DNA，也可用于RNA的扩增；4)可以进行多重扩增。

免疫胶体金技术(Immune Colloidal Gold Technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金免疫层析法是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。