[发明专利]一种工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种四酶共表达的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：它导入了L‑氨基酸氧化酶基因、α‑酮酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和可将NAD(P)还成NAD(P)H的酶基因。本发明还公开了上述重组大肠杆菌的构建方法和应用。本发明方法应用于生物合成苯乙醇类化合物，具有操作简单，成本低，产物合成效率高，光学纯度高的特点，具有良好的产业化前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种共表达四酶的大肠杆菌基因工程菌的构建，以及该工程菌在生产2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇的应用。

背景技术

苯乙醇类化合物(Phenylethanoids)，主要有三种结构类似物：2-苯乙醇(2-Phenylethanol，β-Phenylethanol)、酪醇(对羟基苯乙醇，Tyrosol，4-hydroxyphenylethanol，2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol)、羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，3,4-Dihydroxyphenylethanol，2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)，均为L-α-芳香族氨基酸衍生物。2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰香味的芳香醇，在食品、药品、化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且具有协合及增效作用，是多种香型配方所需的组分。酪醇是红景天苷分子的核心，具有较好的抗氧化性，也是重要的医药中间体，主要用作合成心血管药美多心安，倍它素洛尔等。羟基酪醇被视为最强大的抗氧化剂之一，可消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，防止脑衰，延缓衰老。

目前有植物提取、化学合成、微生物等方法生产这些化合物。化学方法已能成功合成2-苯乙醇、酪醇和羟基酪醇(中国专利200880002426.3、201310183569.1、200910098983.6)，由于这些化合物都是重要的食品或保健品原料，因此化学合成的产品不受人们喜欢。当前市场上的这些产品主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利201510625623.2公开了一种从玫瑰花瓣中提取高纯度2-苯乙醇的方法；中国发专利201410743409.2公开了一种从大花红景天中制备高纯度酪醇的方法；中国专利201710195462.7从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。受植物资源及其含量的限制，这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。

L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-多巴经过脱氨、脱羧、醛基还原可以应生成2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇。基于此代谢原理，数种微生物生产的方法已经被开发。

酵母具有从头合成2-苯乙醇的代谢途径,也可通过氨基酸分解代谢途径将L-苯丙氨酸直接转化为2-苯乙醇，早在1907年Ehrlich过在酵母培养基中添加L-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量得到大幅提高(Ber Dtsch Chem Ges,1907.40:1027-1047)。中国专利02137575.5、200710066884.0、200810071807.9、200910049170.8、200910049565.8、201310243384.5、201410661174.2和201610256845.6均匀公开了采用酵母转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的菌种和方法。Romagnoli开发了一种删除酵母芳香族氨基酸转氨酶，以葡萄糖为底物生产2-苯乙醇，产量约为3mM，同时也会产少量的酪醇(Deletion of theSaccharomyces Cerevisiae Aro8Gene,Encoding an Aromatic Amino AcidTransaminase,Enhances Phenylethanol Production from Glucose.Yeast,2015,32(1):29-45)。由于酵母生长较慢，且在转化过程中会消耗部份L-苯丙氨酸，因此2-苯乙醇的产率较低，成本较高。