[发明专利]一种工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种三酶共表达的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：它导入了L‑氨基酸氧化酶基因、(D/L)‑α‑羟基羧酸脱氢酶基因和可以还原NAD(P)的基因。本发明还公开了上述重组大肠杆菌的构建方法和应用。本发明方法应用于生物合成光学纯α‑羟基羧酸，具有操作简单，成本低，产物合成效率高，光学纯度高的特点，具有良好的产业化前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种共表达三酶的大肠杆菌基因工程菌的构建，以及该工程菌在生产α-羟基羧酸中的应用。

背景技术

α-羟基羧酸(α-羟酸，2-羟酸，α-hydroxy-carboxylic acid，2-hydroxy-carboxylic acid)在自然界广泛存在，其结构特点是羧基侧C位有一个羟基。光学纯α-羟基羧酸是重要的精细化工中间体和手性药物前体。

通常可以把α-酮基羧酸(α-keto carboxylic acids)用作底物，进行化学手性加氢合成α-羟基羧酸，或者酶法合成(中国专利201410818165.X)α-羟基羧酸，但α-酮基羧酸及手性催化剂价格昂贵，产业化较难。

也有通过酯酶水解α-羟基羧酸酯的方法制备光学纯α-羟基羧酸(中国专利200910049768.7)，但酯酶手性选择性差，而且最高只有50％的收率。

另有通过野生菌直接转化L-氨基酸生成α-羟基羧酸，但与基因工程菌相比，效率较低(中国专利201610853578.0)。

中国专利201610080101.3公开了一种通过多酶作用处理外消旋α-羟羧酸生成光学纯2-羟酸的方法，但化学合成的外消旋α-羟基羧酸成本较高。

早在1988年Roth等人提出了先以化学法处理L-二羟苯丙氨酸(L-多巴)得到对应的α-酮基羧酸，再酶法合成(S)-3,4-二羟基苯基乳酸的方法(Enzymatic Synthesis of(S)-(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid,Arch.Pharm.(Weinheim)321,179-180(1988))。WO专利WO2002033110公开了一种通过廉价L-氨基酸为底物，转化生产α-羟基羧酸的方法，该方法首先用氨基酸氧化酶(或表达氨基酸氧化酶的大肠杆菌全细胞)脱掉氨基酸的α-氨基生成对应的α-酮酸，然后将菌体去除(也可不去除)，再加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，羟基羧酸脱氢酶，甲酸脱氢酶等反应一定时间后生成α-羟基羧酸。该方法中NAD价格昂贵，而且反应一定时间后会分解失效，另外羟酸脱氢酶和甲酸脱氢酶都是由不同的菌种培养得到，极大地增加了反应成本。