[发明专利]马铃薯A病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法

说明书

本发明公开了马铃薯A病毒RT‑LAMP鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法,试剂盒包括有：2×反应液缓冲液、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、酶溶液、荧光目视检测试剂、去离子水。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯A病毒RT‑LAMP鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法。

技术领域

本发明涉及一种马铃薯A病毒RT-LAMP鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

马铃薯A病毒Potato virus A是马铃薯Y病毒属Potyvirus的成员，侵染马铃薯后可造成40％以上的损失，和马铃薯A病毒、马铃薯Y病毒混合侵染后，造成的损失更加严重，是马铃薯生产上危害较重的病毒之一。该病毒可随种薯传播，并随种薯的种植而定殖。由于至少有7种蚜虫非持久性传播该病毒，而这些蚜虫在我国又比较普遍，如不对进境种薯及国内调运的种薯进行严格检疫，该病毒传播扩散的可能性就非常大，具有较高的流行风险。因此该病毒具有非常高的检疫重要性，已被列入新修订的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中。该病毒分布于日本、美国、欧洲各国。尽管有分布，在NAPPO和EPPO地区该病毒仍被列为限定的非检疫性有害生物。在已签署的美国、加拿大输华马铃薯种薯检疫议定书中，要求种薯不得携带该病毒。

本世纪以前，国内关于马铃薯A病毒的研究报道较少，主要采用血清学技术和鉴别寄主的方法检测该病毒，由于该病毒和马铃薯Y病毒存在血清学关系，对抗血清的制备技术及质量要求较高，否则会对检测结果产生影响，在实际病害普查的检测中也会出现检测结果不一致的现象，根据实际检测情况分析，很可能与上述因素有关，因此迫切要求提高该病毒的检测水平，研制新技术。

近年来国内相继采用了二重RT-PCR快速检测技术、双引物-Realtime PCR检测技术、一步法多重RT-PCR检测技术、液相芯片技术等进行了有关该病毒检测技术的研究，云南、福建、杭州、黑龙江报道了该病毒的发生情况，但应用环介导等温扩增技术检测该病毒，国内外均未见报道。环介导等温扩增Loop-mediated isothermal amplification,LAMP是一种在恒温条件下特异、高效且快速扩增核酸的技术，该技术针对目的序列设计2对特异引物在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下实现高效扩增，具有高灵敏度和特异性，且操作简单。但目前为止尚未建立针对PVA的RT-LAMP检测技术。本研究根据PVA的外壳蛋白基因序列设计RT-LAMP引物，通过实验最终建立了PVA的RT-LAMP检测方法，为PVA的检测提供了一种快速高效、特异灵敏的新方法，灵敏度高，比普通RT-PCR灵敏度高10倍；并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯A病毒RT-LAMP鉴定用的引物；

本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于鉴定马铃薯A病毒的试剂盒；

本发明另一个目的是提供一种采用上述马铃薯A病毒RT-LAMP鉴定方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种马铃薯A病毒鉴定用的引物，其特征在于包括：

PVA-FIP：

5’-CTTGCATCAAGAGTTTCGGCTT-GATGAACAAATGGATGAAGAAGA-3’

PVA-BIP：5’-CGAAGCACTGCGCAGAAATC-TTGTCCTTCACGGCTACA-3’

PVA-F3：5’-TGGAAAAGTACTCTATCCAGTT-3’

PVA-B3：5’-CTGAATGACAGCAATAACGA-3’