[发明专利]马铃薯A病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1.一种马铃薯A病毒鉴定用的引物，其特征在于包括：

PVA-FIP：

5’-CTTGCATCAAGAGTTTCGGCTT-GATGAACAAATGGATGAAGAAGA-3’

PVA-BIP：5’-CGAAGCACTGCGCAGAAATC-TTGTCCTTCACGGCTACA-3’

PVA-F3：5’-TGGAAAAGTACTCTATCCAGTT-3’

PVA-B3：5’-CTGAATGACAGCAATAACGA-3’

PVA-LB：5’-TGAGTAGGCAGAAAGAGGAGAA-3’。

2.一种马铃薯A病毒鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

3.根据权利要求2所述马铃薯A病毒鉴定用的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：

4.一种马铃薯A病毒鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

A、植物组织总DNA提取；

B、LAMP检测：

采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；

C、LAMP结果判断

扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯A病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯A病毒。

5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：

a.取0.1g植物组织置于液氮中研磨，时间尽量短，保持研钵中有液氮；

b.转移样品到1.5mL Rnase free离心管中，加入1mL的PL裂解液颠倒混匀，65℃条件下进行孵育5min，使核蛋白体分解完全；

c.室温条件下12000rpm离心10min后，取上清转入新的RNase free过滤柱中；

d.10000rpm离心45s，收集下滤液于收集管中，进行下一步的操作；

e.收集管中加入1倍体积的70％乙醇，颠倒进行混匀，得到的溶液以及沉淀一起转移到吸附柱RA中，量太多可分次进行过柱；

f.10000rpm下离心45s，弃掉废液后，重新将吸附柱放回收集管中；

g.加入500μL去蛋白液RE，12000rpm下离心45s，废液弃掉；

h.加入700μL漂洗液RW，12000rpm下离心60s，废液弃掉；

i.加入500μL漂洗液RW，12000rpm下离心60s，废液弃掉；

j.将吸附柱RA重新放回收集管中，12000rpm离心2min，除去漂洗液，以免抑制下游反应；

k.取出吸附柱RA，取一个新的RNase free离心管中放入，根据所预期基因组和RNA的产量在吸附膜中间部位加50-80μL RNase free water，室温下放置2min后12000rpm离心1min。