[发明专利]一种利用离子液体和蛋白酶提取柞蚕丝丝素蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及丝素蛋白提取领域，尤其涉及一种利用离子液体和蛋白酶提取柞蚕丝丝素蛋白的方法。

背景技术

蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，其中丝素蛋白约占70%，是蚕丝的主要成分。丝胶为球状蛋白，组成氨基酸中含有大量极性亲水侧基，稳定性差，可溶于酸、碱、蛋白酶以及低浓度碳酸钠等溶液中；而丝素为纤维状蛋白，天然丝素纤维含有大量分子内和分子间氢键, 结晶度较高而难溶解于一般溶剂。

生活中比较常见的是桑蚕丝和柞蚕丝，主要由甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）组成，但氨基酸含量和分布差异较大。在柞蚕丝素中，具有活泼基团的氨基酸（如精氨酸、天冬氨酸等）比桑蚕丝多，色氨酸、组氨酸的含量是桑蚕丝的5倍，柞蚕丝的丙氨酸含量为40%，桑蚕丝为30%。故柞蚕丝中肽链的弯曲和缠结程度比桑蚕丝大，这就使柞蚕丝的刚度、耐溶剂能力高于桑蚕丝。

目前，在研究过程中，常采用强酸、强碱、高浓度的盐溶液如高浓度CaCl₂溶液、铜氨溶液、溴化锂溶液、硫氰化锂溶液等对桑蚕丝丝素蛋白进行溶解,但这些溶剂存在对蛋白质分子降解严重、有毒害、不稳定、不易回收等缺点，同时对柞蚕丝丝素蛋白的提取效果较差。

离子液体(IL)是近年来兴起的一类极具应用前景的绿色溶剂,广泛应用于电化学 、有机合成 、化工分离 、材料制备等领域。所谓的离子液体就是在室温（或者稍高于室温的温度）下呈液态的离子体系，与常见的有机溶剂不同，离子液体中存在强大的静电相互作用，因此表现出非同寻常特点：非挥发性、高稳定性、良好的导电与导热性、选择性溶解力与可设计性，同时具有环保无害、可循环使用的特性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用离子液体和蛋白酶提取柞蚕丝丝素蛋白的方法。本发明的提取方法较为温和，对丝素蛋白损伤小，使用原料环保，无毒害，且提取效率较高。

本发明的具体技术方案为：一种利用离子液体和蛋白酶提取柞蚕丝丝素蛋白的方法，以g和mL计，包括以下步骤：

1）称取3.5-4.5g柞蚕丝，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。

2）将烘干的柞蚕丝以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%的Na₂PO₄和0.8-1.2wt%的C₁₇H₃₅COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶四次。

脱胶过程中，随着丝胶的水解，溶液中氨基酸的浓度逐渐增加，pH降低，脱胶效率减弱，所以需加碱以维持脱胶液pH值的稳定，但碱浓度过大会损伤丝素，所以采用C₁₇H₃₅COONa作为缓冲剂。

3）脱胶之后，将柞蚕丝用去离子水搓洗4次以上，放入55-65℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。

4）称取1.8-2.2g干燥的丝素纤维，以1:45-55的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中，控制反应温度在80~100℃范围内，在油浴中搅拌5-7h，反应完成后，冷却至室温。

5）向步骤4）中离子液体内加入PM₁₃-碱性蛋白酶粉末0.25-0.35g，在40~55℃的油浴中搅拌5-7h，得到丝素/离子液体溶液后，进行灭酶。

生物酶是一种无毒无害、与环境友好的催化剂，拥有高效的特异性；且用量少，水解条件（温度、pH）温和，减少污染，节约资源。离子液体(IL)是近年来兴起的一类极具应用前景的绿色溶剂，对丝素蛋白表现出一定的溶解性。

本发明采用PM₁₃对碱性蛋白酶进行修饰，以保持碱性蛋白酶在离子液体中的稳定性和活性。碱性蛋白酶本身也是一种蛋白质，离子液体对其结构具有一定的破坏作用，PM₁₃处是一种梳状共聚物，可以覆盖在碱性蛋白酶表面，防止碱性蛋白酶被离子溶液破坏，同时借助PM13链对IL的亲和性，不但可以提高酶的稳定性，保证酶在离子液体中的活性，而且使酶均匀的分散在IL中。