[发明专利]一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法

说明书

本发明涉及一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，属于生物医药的分离纯化。所述方法包括在水蛭素发酵液中加入疏水色谱填料进行吸附，吸附沉淀洗脱后，即得分离色素分子的水蛭素蛋白。整个吸附洗脱过程操作简单，分离色素的同时还具有一定的纯化作用，水蛭素蛋白回收率可达70％。

技术领域

本发明涉及一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，属于生物医药的分离纯化。

背景技术

1884年，人们在医用水蛭(hirudo meduimalis)中发现有很强的抗凝物质，命名为水蛭素(hirudin Hir)。到1950年以后，从医用水蛭唾液腺中分离得到具有生物活性的水蛭素。七十年代初确定，水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂。八十年代，确定了水蛭素的氨基酸序列，并对其构数关系及其生物学作用机理进行了一系列研究，水蛭素是一个由多种异构体所组成的家族，常见有三种分别为HV-1、HV-2和HV-3，异构体间有高度的同源性，都是由65个氨基酸所组成的单链多肽，分子量约为7000Da，氨基酸组成分析表明，水蛭素分子中不含精氨酸和色氨酸，而富含谷氨酸、天门冬氨酸以及谷氨酰胺和天门冬酰胺，比活性约为10000IU/mg蛋白。

由于水蛭素具有重要的医药价值，而天然水蛭素来源限制，故国内外医药界均着重研究通过基因工程获得重组水蛭素。基于已知的水蛭素氨基酸序列，在体外合成相应序列DNA片段，插入重组表达载体，在大肠杆菌和酵母细胞中表达。毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是具有分泌优势的高表达真核系统。其分泌表达量高，酵母工程菌稳定性好，高密度发酵条件下，能大大提高产物的表达水平等。

重组水蛭素的成功构建表达后，需要对重组水蛭素进行分离纯化工作，优化的分离纯化方法可以使水蛭素纯度提高，成本降低。传统的分离重组水蛭素以去除色素分子多采用两步法：1、超滤膜浓缩水蛭素；2、低温乙醇沉淀浓缩后的水蛭素，分离色素分子。现有的分离技术具有以下难点:1、两步法超滤浓缩--乙醇沉淀后水蛭素活性蛋白回收率在40％左右，蛋白回收率较低；2、因发酵过程中会产生蛋白降解酶，而该降解酶会水解水蛭素活性，因此超滤浓缩时间过长，不利于水蛭素活性的稳定；且超滤膜的消耗较大，浓缩成本高；3、两步法乙醇使用量大，不利于环保。

发明内容

本发明的目的是针对目前现有分离技术出现的问题，提供一种快速分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，使用疏水作用色谱分离提纯，提高水蛭素蛋白回收率。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法，所述方法包括在水蛭素发酵液中加入疏水色谱填料进行吸附，吸附沉淀洗脱后，即得分离色素分子的水蛭素蛋白。

疏水色谱填料由化学性质稳定、机械强度好的载体和疏水表面基团组成，因而疏水色谱填料的表面具有弱疏水特性。而水蛭素蛋白表面存在一些疏水区域，蛋白质分子中的疏水区域可以与填料表面产生疏水性相互作用而被吸附，而发酵液中色素分子的疏水性要远远小于水蛭素蛋白，其与疏水色谱填料吸附性不强，当水蛭素发酵液经疏水色谱填料吸附洗脱时，根据疏水性差异，疏水性低的色素分子先被洗脱出来，水蛭素蛋白随后被洗脱出来，从而实现色素分子与水蛭素蛋白的分离。且水蛭素蛋白与疏水色谱填料的疏水作用是一种很温和的相互作用，在洗脱后能保持蛋白分子的结构和活性。

作为优选，所述疏水色谱填料由硅胶基质以及表面键合苯甲基基团形成。硅胶表面键合苯甲基基团，苯甲基基团的疏水性要大于普通的羟丙基、甲基、丙基等键合基团，表面键合基团疏水性越大，水蛭素蛋白与之疏水作用越强，吸附洗脱的时间越长，从而更易与色素分子分离，但是硅胶表面键合基团的疏水性太强，会导致蛋白质分子不可逆吸附和生物活性损失，因此本发明选择苯甲基基团作为硅胶表面键合基团。