[发明专利]MTHFR‑A1298C基因多态性快速检测引物、分子信标、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种MTHFR-A1298C、RS1801131基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

背景技术

核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸(A、T、C、G)的变异所引起的DNA序列的多态性。与许多疾病相关，决定着人类疾病的易感性和药物反应的差异性。因此，SNP在分析诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面具有重要的应用价值。

分子信标(molecular beacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。其在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸分子信标，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近(约7～10nm)。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，从而，分子信标的荧光几乎100％恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。分子信标具有背景信号低,灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未反应的分子信标分离即可实时检测，可用于活体分析等优点。在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。

叶酸(folic acid)也叫维生素B9。参与着机体的很多重要代谢反应。叶酸最重要的功能就是制造白血球和红血球，可增强免疫能力，一旦缺乏叶酸，会产生严重贫血，因此，叶酸又称为“造血维生素”。叶酸对孕妇尤其重要，需求量比正常人高4倍。孕早期是胎儿器官系统分化及胎盘形成的关键时期，此时叶酸缺乏可导致胎儿畸形。Shaw和他的同事们在1995 年时就报道了妇女在妊娠开始后的1-2个月之间服用复合维生素能使子代大大降低心脏流出道畸形的概率。据报道，早期孕妇叶酸缺乏的发生率为19.23％，此发生率虽然低于欧洲、美国等国家(16％-60％)，但高于国内1986年的(9.9％)报道。研究还发现人的N5、N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因编码是叶酸代谢的关键酶。其功能主要是与胸腺嘧啶合成酶共同作用促成脱氧尿嘧啶核苷酸(dump)接受5-甲基四氢叶酸(5mTHF)提供的甲基转变成脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP),进而参与到DNA的合成。MTHFR基因位点的突变都会引起相应的酶的活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，会导致低叶酸血症。MTHFR(A1298C， rs1801131)有A/A、A/C、C/C三种基因型，其位点是A(腺嘌呤)→C(胞嘧啶)突变，导致其编码的MTHFR氨基酸序列中第429位点的谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代，从而影响 MTHFR酶的活性。最终影响代谢酶的活性。

目前针对SNP的检测方法有很多种，根据是否需要凝胶电泳和自动化程度的高低，大致可以分为两大类，即基于凝胶电泳的SNP检测方法和高通量、自动化程度较高的SNP检测方法。基于凝胶电泳的SNP检测方法包括单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)。总的来说，这些方法对设备要求不高，且投入成本低，但速度慢，结果有不确定性且很难实现高通量的SNP检测。高通量、自动化程度较高的SNP检测方法有直接测序法，该方法费用贵且对杂合体不易分型；基因芯片法，该方法虽然快速高效，但是杂交条件与DNA的GC含量密切相关，需要找到一种普遍性的杂交条件，同时需解决重复序列对杂交准确度的影响；芯片造价昂贵；变性高效液相色谱 (DHPLC),该方法自动化程度和检测准确率高，但对试剂盒环境的要求较高，不能检测出纯合突变；高分辨率溶解曲线法，该方法通量高，成本低，结果准确但对设备的温度均一性有着严格的要求。且以上方法都需提取DNA才能进行检测。耗时长,操作复杂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低且检测快速、时间短的 MTHFR-A1298C、RS1801131基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：MTHFR-A1298C、RS1801131基因多态性快速检测的试剂盒，包括PCR反应液，PCR反应液的原料及终浓度为，