[发明专利]一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用，用于检测微卫星不稳定性的组合物包括分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对，用于检测微卫星不稳定性的试剂盒采用特异性的多重荧光PCR片段分析毛细管电泳法检测Bat 26、Bat 25、NR‑21、NR‑24、NR‑27、Mono‑27、D5S346、D2S123和D17S250这9个位点和Penta C、Penta D、Amel这3个位点的微卫星分布情况，用于判断微卫星是处于稳定还是不稳定状态。通过调整12对引物的配比、Taq酶的用量、镁离子的用量和PCR体系等，提高整个试剂盒的敏感性和特异性。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测微卫星不稳定性的技术。

背景技术

结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)发生的遗传因素包括染色体不稳定性(Chromosome Instability,CIN)和微卫星不稳定性(Microsatellite Instability,MSI)。约80-85％的CRC由CIN引起，包括家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatouspolyposis,FAP)(APC基因胚系突变)和散发性CRC(APC、P53、DCC、KRAS等基因突变)；而另外15-20％的CRC则主要是由MSI引起，包括遗传性非息肉病性结直肠癌(HereditaryNonpolyposis Colorectal Cancer,HNPCC，又称Lynch综合征)(错配修复基因胚系突变)和散发性MSI(+)CRC(错配修复基因MLH1基因启动子甲基化)。

微卫星不稳定(Microsatallite Instability，MSI)表现为同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。近年来的大量研究表明：MSI与肿瘤发生密切相关，如结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。尤其是结直肠癌，临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物。据文献报道，大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI-H的II期结直肠癌患者预后较好，但从5-FU辅助化疗获益较少。

Lynch综合征，亦称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，是由MMR基因胚系突变所致的显性遗传病。90％以上的Lynch综合征具有MSI特征，而散发性结直肠癌中只有约15％，所以临床上可用MSI检测来进行Lynch综合征的筛查。

2015年在新英格兰医学杂志发表的NCT01876511研究结果表明，PD-1单抗治疗对MSI-H的mCRC表现出高缓解率，因此PEMBRO单抗治疗MSI-H的mCRC获得FDA突破性疗法认定。2016年ASCO年会上发布的CheckMate-142，Ⅱ期研究的数据表明，MSI-H的mCRC患者不仅可从PD-1免疫治疗获益，而且对PD-1和CTLA-4联合治疗的临床活性和生存期都远远超过了单独使用PD-1的疗效。2017年5月23日，美国FDA批准了默沙东公司的“明星”PD-1抗体pembrolizumab(商品名：Keytruda)用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤，具体来说，Keytruda被批准用于治疗携带“MSI-H/dMMR亚型”的成人和儿童实体瘤患者。

1997年，NCI推荐使用Bat 26、Bat 25、D5S346、D2S123和D17S250 5个位点检测肿瘤，若其中2个或2个以上位点有改变则为高频率MSI(MSI-H)，有1个位点改变则为低频率MSI(MSI-L)，没有改变则称为微卫星稳定(MSS)。在2002年NCI研讨会中，由于双核苷酸D5S346、D2S123和D17S250位点的灵敏度和特异性检测受限、均低于单核苷酸，修改了MSI检测指南，主要推荐使用更多的单核苷酸进行检测(在双核苷酸不稳定情况下)。目前研究报道，检测的单核苷酸位点有Bat 26、Bat 25、NR-21、NR-24、NR-27、Mono-27，双核苷酸位点有D5S346、D2S123和D17S250。