[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达及其ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达方法，其特征在于：包括以下步骤：PCR反应体系50L，由10×PCR Buffer 2-4L、MgCl2(25mM)1-5L、dNTP(10mM)1-3L，Nsp2-1/Nsp2-2引物各1-3L、Taq酶0.5-2L、cDNA适量1-3L、去离子水补足至50而成；PCR反应参数为：90-98℃2-4min预变性，然后进行30个循环，90-98℃，25-35s、52-60℃，25-35s、68-76℃40-60，最后68-76℃延伸4-6min；引物为Nsp2-15′-CGCGGATCCGACACCTCCTTTGATTGGAAT-3′，酶切位点BamHⅠ，Nsp2-25-CCGGAATTCCGAACCGTTAGGGACATTGTC-3，酶切位点EcoRⅠ，预扩增长度：606bp。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达方法，其特征在于：包括以下步骤：PCR反应体系50L，即10×PCR Buffer 3L、MgCl2(25mM)2.5L、dNTP(10mM)1L，Nsp2-1/Nsp2-2引物各2L、Taq酶1L、cDNA适量、去离子水补足至50L；PCR反应参数为：94℃3min预变性，然后进行30个循环，94℃，30s，56℃，30s、72℃，50s，最后72℃延伸5min；引物为Nsp2-15′-CGCGGATCCGACACCTCCTTTGATTGGAAT-3′，酶切位点BamHⅠ，Nsp2-25′-CCGGAATTCCGAACCGTTAGGGACATTGTC-3，酶切位点EcoRⅠ，预扩增长度：606bp。

3.一种PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：包括80-120μL重组蛋白包被、80-120μL阳性对照、80-120μL阴性对照、80-120酶标二抗、80-120μL底物液及80-120μL终止液。

4.根据权利要求3所述的PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：包括100μL重组蛋白包被、100μL阳性对照、100μL阴性对照、100酶标二抗、100μL底物液及100μL终止液。

5.根据权利3或4所述的PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的重组蛋白包被的浓度为8.123μg/mL，阳性及阴性对照血清的稀释比例为1:40、酶标二抗的稀释度为1:1000。

6.根据权利3或4所述的PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为PRRSV分离毒注射于未免疫过的猪制备的阳性血清，阴阳性其临界值为0.3；阴性对照为未感染和未免猪繁殖与呼吸综合征疫苗的血清，稀释度 为1:40。

7.根据权利3或4所述的PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的血清稀释液为BSA的浓度为1g/100mL，封闭液为BSA的浓度为1g/100mL，所述的底物液是四甲基联苯胺，终止液是浓度为2mol/L的硫酸。

8.根据权利要求7所述的PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的四甲基联苯胺(TMB)底物液的配方为：显色底物溶液：先将TMB以0.1mol/L的浓度溶于二甲基亚砜，然后，再将其以1mmol/L和H202以3.0mmol/L的浓度溶于0.2mol/L醋酸钠/枸橼酸缓冲液(pH4.0)，即可应用；终止液：2mol/L硫酸；测定波长：450nm。

9.一种PRRSV中Nsp2蛋白的ELISA试剂盒制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)取空白酶标板，于每孔中加入100μL的Nsp2蛋白溶液，于振荡器上混匀，加盖封口膜4℃包被过夜；

(2)弃去孔内剩余液体，用洗涤液(1×PBST)洗涤ELISA板5次，在吸水纸拍干；

(3)每孔加入封闭液100μL，37℃封闭1h；

(4)重复步骤(2)；

(5)将一抗稀释到工作浓度，每孔加入100μL，轻轻振荡后，37℃作用1h；

(6)重复步骤(2)；

(7)将酶标二抗羊抗猪IgG-HRP稀释到工作浓度(1:1000)，每孔加入100μL，轻轻振荡后，37℃作用1h；

(8)重复步骤(2)；

(9)每孔加入100μL底物液，37℃避光温育15min；

(10)每孔加入终止液(2mol/L H2SO4)100μL终止反应，立即在酶标仪450nm波长下读取光吸收值。