[发明专利]焦磷酸测序法检测绿脓杆菌gyrA基因和parC基因多态性的引物对及试剂盒

说明书

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测绿脓杆菌gyrA基因和parC基因多态性的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂盒。通过对绿脓杆菌gyrA基因和parC基因各自两处易突变的位置进行引物设计，具体针对gyrA基因的Thr‑83和ASP‑87以及parC基因的Ser‑87和Ala‑88的多态性进行分析。本发明的试剂盒可以实现对绿脓杆菌gyrA基因和parC基因多态性的准确、快捷、高通量的检测。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测绿脓杆菌中gyrA基因和parC基因多态性的引物对及试剂盒。

背景技术

绿脓杆菌（也称铜绿假单胞菌）是一种非常重要的机会感染菌，可以占到所有医院感染的10%。而且对免疫功能低下的患者，例如严重烧伤、癌症、艾滋、移植手术患者、介入治疗患者等，危害尤其巨大，高达28%的这类患者可能感染绿脓杆菌^[1-2]。不仅如此，绿脓杆菌因其内在的机制，或者通过获得性的方式，极易产生广谱耐药性。目前氟喹诺酮类药物是唯一有效的口服治疗药物^[3]。在氟喹诺酮类药物中，环丙沙星和左氧氟沙星是应用最为广泛的治疗绿脓杆菌感染的药物。

氟喹诺酮类药物是通过抑制两类重要的酶活性，DNA螺旋酶（DNA gyrase）和拓扑异构酶IV（topoisomerase IV）来实现细菌的增殖作用的，而这两类酶均是DNA复制过程中的关键酶。基因分析发现，这两个酶是有异四聚体机构蛋白，由两个亚单位构成。这两个亚单位又分别由四个基因编码，分别是gyrA，gyrB，parC和parE ^[4]。其中gyrA、gyrB与parC、parE是相互对应的同源基因。在大量的临床耐药性分析中发现，绿脓杆菌对氟喹诺酮药物的耐药性主要是来源于在所谓喹诺酮耐药决定区（QRDR）区域的DNA螺旋酶和拓扑异构酶IV的突变^[5-6]。而同在这一区域的四个基因中，又以gyrA和parC的突变频率最为普遍，是最重要的喹诺酮耐药基因位点。而且文献显示parC基因突变可以大大增强gyrA基因突变所造成的氟喹诺酮耐药性。因此，这两个位点的突变检测成为绿脓杆菌氟喹诺酮耐药性监测的主要检测靶点^[7]。

目前临床实验室针对绿脓杆菌的氟喹诺酮耐药监测依然是以先扩增培养，然后采用MIC法对其药物敏感性进行检测的方法。通常从采集样本到获得耐药性结果的时间需要4-5天左右，耗时长，对危重患者的治疗影响极大。由于gyrA和parC突变是造成绿脓杆菌氟喹诺酮耐药的关键因素，而针对gyrA和parC突变的分子检测技术中也得以开发，包括荧光原位杂交（FISH）和固相生物芯片技术，这些技术结果直观，但重复性差、灵敏度不高，操作繁琐成为其突出弱点。定量PCR技术的准确性高，灵敏度高，但是需要针对不同的突变方式设定引物，引物复杂，一个样本需要多个反应通道，造成通量不足的问题，同时提高了检测成本，不能真正满足临床诊断的需要。

焦磷酸测序是一种新型的酶联级联测序技术，是基于对序列大体已知的短序列分析方法。相对于一代的Sanger DNA测序法，焦磷酸测序更加快捷简便，成本很低，且重复性和准确性好，同时还能够实现高通量的检测。由于焦磷酸测序法针对已知短序列的特点，使其在单核苷酸多态性（SNP）的鉴定、甲基化分析、细菌分型、遗传多态性方面的独特优势，因此也在临床上被用于检测病原菌的耐药性突变位点^[8]。本发明采用了自己的引物设计，实现了样本需求量小，检测快速，结果准确，高通量的特点，符合现在临床快速、简洁、高通量的需求。

发明内容

本发明旨在提供一种利用焦磷酸测序法检测绿脓杆菌gyrA基因和parC基因多态性的试剂盒和方法，以实现快速、准确、经济的绿脓杆菌对喹诺酮耐药的检测。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测绿脓杆菌gyrA基因和parC基因多态性的试剂盒包含如下内容物：

（1）针对两种基因的PCR扩增引物：