[发明专利]一种PCR无效扩增的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外DNA扩增检测领域，具体地说是涉及用于核酸体外扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)中无效扩增的检测方法。

背景技术

为了避免传统PCR的缺陷，并对PCR扩增产物或基因表达水平进行定量分析，1992年诞生了“第二代PCR”分析技术—实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR(real‐time fluorescent quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例的增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。在低拷贝靶基因分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测灵敏度、精确度和分辨率都受到了限制。

在低丰度检测、稀有突变检测等日益增大的应用需求背景下，“第三代PCR”—数字PCR技术诞生(一种核酸分子绝对定量技术)。数字PCR是把荧光定量反应体系均匀地分配到大量微小的反应单元中，每个微小反应单元中不包含或包含一个到多个目标基因片段。扩增结束后，通过终点荧光信号判断的阳性反应单元的数量所占总的反应单元的比率和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。

数字PCR无须依赖对照样品和标准曲线就可以进行比较精度的绝对定量检测，这是由于数字PCR在进行结果判读时仅判读“有/无”两种扩增状态，完全不依赖于Ct值的鉴定。由于数字PCR是终点检测法，只是对终点荧光一次检测进行靶基因的初始浓度计算，对每个反应单元中基因扩增的整个过程是不关注的，这就有可能让假阳性和假阴性等无效扩增参与计算，将导致靶基因浓度计算精度降低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种PCR无效扩增的检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种PCR无效扩增的检测方法，该方法根据PCR检测结果，通过确定第一阈值和第二阈值检测出假阳性、假阴性及波动超限产生的无效扩增。

进一步地，所述第一阈值R1为至少包含3～20个循环周期的荧光信号标准偏差的3～15倍，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期。或为第C_n个周期的荧光强度值，第C_n个周期的荧光强度值满足：

其中C_n代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。

进一步地，所述第二阈值R2为终点荧光检测的阴阳分割值。

进一步地，无效扩增的检测方法如下：

若终点阈值R>R2时，判定为待定阳性；将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki>＝K时，判定为阳性，否则为假阳性；

若终点阈值R<R1时，判定为阴性；

若终点阈值R1＝<R<＝R2时，判定为待定阴性。将阈值线y＝R1与阈值线y＝R2之间增长区的最大斜率Ki与扩增效率K值进行比较，当Ki<＝K时，判定为阴性，否则为假阴性；

假阳性和假阳性均为无效扩增。

若扩增曲线在扩增结束前L个周期之间的荧光值波动大于这L个周期的荧光值均方差的2～5倍，L取3‐15，则判定为波动无效扩增。本实施例L取典型值5，荧光值波动大于均方差的倍数选取3倍。

若扩增曲线在扩增的3‐15个循环周期之间，其中，起始周期为第2～10个循环周期，结束周期为第10～25个循环周期，荧光值恒定且高于第一阈值线R1，则判定该扩增为无效扩增。

本发明的有益效果在于：通过本发明，可以有效的检测出PCR扩增过程中产生的假阳性/假阴性及其他无效扩增，有利于获得更为精准的PCR检测结果。

附图说明

图1为本发明实施例的精度与假调用的关系图；

图2为本发明实施例的定量PCR实时荧光扩增曲线图；

图3为本发明实施例的识别假阴性假阳性方法流程图；

具体实施方式