[发明专利]一种多倍PCR扩增方法

说明书

本发明提供了一种多倍PCR扩增方法，即以一对5’端与通用引物相同的多个相同序列组成的多倍引物(低浓度)和一对通用引物(高浓度)在同一PCR反应中进行扩增，扩增中所用DNA聚合酶是具有链置换作用的耐热聚合酶。多倍引物序列包含两部分，即3’端与目标基因互补，5’端携带至少1个与通用引物相同的序列。上、下游多倍引物5’端携带通用引物的数目相同或不同，且上、下游通用引物的序列也可以相同或不同。本方法一次循环同时产生多个扩增产物，且每一个扩增产物除含有目标扩增序列外还含有至少一个上游和一个下游通用引物序列。本发明因一次循环可以产生超过两倍的扩增产物，故能显著提高PCR的扩增效率和检测灵敏度，适合作为常规分子生物学实验室手段和医学核酸检测手段用于低模板数基因的检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种多倍PCR扩增方法。

背景技术

PCR技术作为一种体外快速扩增特定基因的方法，因其高特异性和灵敏度等优点已广泛应用于各领域。PCR方法的关键是根据目标基因设计一对具有高严谨性的寡核苷酸引物，通过DNA聚合酶酶促反应实现快速扩增。

自PCR技术发明以来，虽然各种改进和衍生的方法层出不穷，但是都未能突破其基本模式，即每一个目标基因的扩增都是通过与模板互补的一对上下游引物进行的。常规PCR使用一对引物进行扩增，每次循环最多只能产生两倍的扩增产物，故其扩增效率受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供了一种多倍PCR扩增方法，以突破现有技术中每次循环最多只能产生两倍扩增产物的极限，从而提高PCR的扩增效率及缩短PCR反应时间。

本发明的多倍PCR扩增方法，所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增，所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物，且以链替换作用的耐热DNA聚合酶代替常规的DNA聚合酶。以较低浓度的多倍引物在最初的几个循环中引发PCR，产生包含通用引物序列的第一扩增产物；以第一扩增产物为模板，在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下，使用较高浓度的通用引物扩增PCR。对于目标基因，一次循环可以产生超过两倍的扩增产物，从而提高PCR的扩增效率以及缩短PCR扩增时间。

本发明的第一个方面是提供一种多倍PCR扩增方法，包括利用一对3’端与目标基因互补的特异性序列及5’由多个通用序列所构成的多倍引物完成第一轮扩增，产生包含通用引物序列的第一扩增产物；以第一扩增的产物为模板，在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下，利用通用引物完成第二轮扩增，产生多条携带目标基因序列的扩增产物；其中多倍引物和通用引物同时加入，在同样的退火温度条件下进行反应。

本发明的第二个方面是提供一种多倍PCR扩增所用引物的设计，包括多倍引物和通用引物。

所述多倍引物浓度为5-100nM；多倍引物的3’端与目标基因序列完全互补，其序列可用引物软件设计，应符合通常优秀引物的高严谨性，序列长度为10-30碱基；5’端包含至少一个与通用引物完全相同的序列，其序列间可用碱基连接；多倍引物形成发夹结构的碱基数应尽量低，且自身总互补碱基数应尽量低。

多倍引物的上、下游序列包含的通用引物数相同或不同，但一个体系中上、下游多倍引物所包含通用引物序列总数目至少为3个。

所述通用引物浓各为l-10μM；通用引物序列与目标基因序列无关，其设计完全独立于被测基因；其物序列长度为10-30碱基；通用引物的退火温度与多倍引物3’端特异性序列的退火温度相差不超过4℃；上游通用引物和下游通用引物的序列可以相同或不同。

多倍引物和通用引物与其它PCR反应试剂一起混合，两轮PCR扩增在相同退火温度下进行，在反应的最初几个循环中有较低浓度的多倍引物完成，而通用引物由于其序列与目标基因不匹配，完全起不了作用。

本发明的多倍PCR扩增方法比常规PCR方法有很多优势：