[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌、全细胞催化剂及莱鲍迪苷A的合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及食品化工领域，尤其涉及蔗糖合成酶基因表达的毕赤酵母工程菌以及重组毕赤酵母在催化合成莱鲍迪苷A中的应用。

背景技术

甜菊糖(Steviol glycoside)是一种具有很多优良特性的高甜度天然甜味剂，在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。甜菊糖带有后苦味和甘草异味，混合物组分复杂，难以对其质量规格进行统一，限制其应用。甜菊苷(Stevioside)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)是甜菊糖中含量最丰富的两种成分，分别占干叶重的5-10％和2-4％。莱鲍迪苷A(RA)是一种无毒、安全、低热能、高甜度的天然甜昧剂，其甜度是蔗糖的150-300倍，热值仅为蔗糖的1/300，而且口味纯正，没有后苦味；因而具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法有：培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性。但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。因此，建立一种高效合成莱胞迪苷A的方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种表达蔗糖合成酶Sus1的重组毕赤酵母工程菌及其构建方法。

本发明所解决的技术问题还在于将共表达蔗糖合成酶Sus1的重组毕赤酵母工程菌作为全细胞催化剂用于合成莱鲍迪苷A。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA序列的表达载体转化到毕赤酵母而获得：

所述外源DNA为编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述蔗糖合成酶Sus1的氨基酸序列如Seq No.1所示。所述外源DNA序列如Seq No.2所示。

其中，所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA，得到的胞内表达载体pPICZA-Sus1。

优选地，所述重组毕赤酵母工程菌是所述胞内表达载体pPICZA-Sus1线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。

另外，本发明还提供了一种全细胞催化剂，包含本发明的重组毕赤酵母工程菌。

优选地，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：

所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：

挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵3天后在6000rpm，4℃离心5min回收菌体；冻干后即为重组毕赤酵母全细胞催化剂。

另外，本发明还提供了一种莱鲍迪苷A的合成方法，该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以上述方案中的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。

优选地，该方法包括如下步骤：

包括如下步骤：

(1)按如下组分及其浓度制备反应体系；

50mM PBS缓冲液，

3mM MgCl₂，

50mM蔗糖，

1mM UDP，

10mg/mL甜菊苷；

(2)加入菌体量为30OD重组毕赤酵母与30OD菌体量的全细胞催化剂，于37℃进行反应，反应12h后停止反应；

(3)将反应液稀释5倍后，用0.2um水系尼龙膜过滤后用液相色谱检测RA的合成。

与现有技术相比，本发明优点在于：

与现有技术相比，本发明优点在于：构建得到的重组毕赤酵母工程菌能实现Sus1的胞内表达；发酵获得的全细胞催化剂可与表面展示UGT76G1菌株联合催化合成RA，RA产量达到2.2mg/mL。不仅提高了莱鲍迪苷A(RA)的合成效率和原料使用率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A(RA)的生产加工开辟新的工业化途径。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1为重组毕赤酵母全细胞催化剂合成RA。A、B分别为反应前后的液相色谱检测结果。ST和RA的出峰时间分别为10.1min和10.8min左右。

具体实施方式

下面结合具体制备实施例和应用实施例，对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。