[发明专利]一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得该基因的全基因序列并测序；2）根据步骤1）得到的DNA序列确定实验的DNA片段，PCR扩增并纯化DNA片段；3）将步骤2）得到的DNA片段利用微量注射的方法注射入昆虫体内；4）对步骤3）的昆虫进行RT‑qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

技术领域

本发明涉及一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，属于生物技术领域。

背景技术

同源依赖性基因沉默被广泛应用于分子生物学的研究，主要通过降低转录产物而减少蛋白的合成，从而使其丧失原有的功能。目前用于调控基因表达的同源片段大多数为反义RNA与双链RNA；随着研究的发现，DNA片段的导入也可引起基因的沉默，被称为DNA干扰（DNA interference）。

目前的研究指出，将铁线蕨内源基因的dsDNA片段引入配子体细胞可引起基因的沉默，使内源基因的表达量降低（Kawai-Toyooka H., Kuramoto C., Orui K., et al.DNA Interference: a Simple and Efficient Gene-Silencing System for High-Throughput Functional Analysis in the Fern Adiantum [J]. Plant and CellPhysiology, 2004, 45 (11): 1648-1657）；无启动子的基因在水蕨上也能导致合成叶绿素必需的镁螯合酶基因CrChlI以及CrFtsZ和CrUrod的基因沉默（Rutherford G,Tanurdzic M, HASEBE M, et al. A systemic gene silencing method suitable forhigh throughput, reverse genetic analyses of gene function in ferngametophytes [J]. BMC Plant Biology, 2004, 4(1): 6）；此外，在尾海鞘的胚胎中，导入纯化的PCR产物，也可使基因的表达量降低，且基因的5’UTR、3’UTR，以及外显子和内含子的导入都可引起基因的沉默（Omotezako T, Onuma T A, Nishida H. DNA interference:DNA-induced gene silencing in the appendicularian Oikopleura dioica [J].Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences, 2015, 282(1807):doi.org/10.1098/rspb. 2015.0435）；另外，将含有GFP基因全长cDNA序列的无启动子质粒转入整合有GFP基因的胰腺癌Panc-l细胞中，可观察到细胞中荧光的表达强度下降，且蛋白的表达也减少（任新瑜, 梁智勇, 师晓华, et al. 同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达 [J]. 中华病理学杂志, 2007, 36(8):539-543）。

目前，虽然已在部分生物体内发现PCR产物抑制基因表达的现象，但是在昆虫中至今还未有报道。因此，我们结合这一现象设计了以下的试验，以求通过PCR产物来达到抑制小菜蛾基因的表达。

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：

1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得其DNA序列并测序；