[发明专利]检测微卫星不稳定性的多重荧光PCR扩增试剂及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测微卫星不稳定性的多重荧光PCR扩增试剂及试剂盒。该PCR扩增试剂包括分别针对微卫星位点BAT25、BAT26、D2S123、D5S346及D17S250设计的上游引物和下游引物，能够在同一PCR体系中同时扩增多个微卫星位点并进行多重荧光PCR检测微卫星不稳定性。各微卫星位点的扩增产物经电泳检测后产生的荧光峰没有交叉重叠的现象，检测效率高，灵敏度好。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种检测微卫星不稳定性的多重荧光PCR扩增试剂及试剂盒。

背景技术

微卫星又称短串联重复序列(Short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(Simple sequences repeats,SSRs)，广泛分布于人类基因组中。重复序列一般由1～6个核苷酸组成，特别是以二核苷酸重复序列即(CA/GT)n最为常见，n为重复次数，通常为15～60次。微卫星能自身特异性的结合蛋白质或直接编码蛋白质，有的则可能参与染色单体的折叠或端粒的形成等。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥基因调控作用，是一类新的、多态信息容量高的分子标记。

微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)是指由于错配修复或复制错误等引起的简单重复序列的增加或丢失，导致微卫星的长度发生改变。MSI发生的主要原因是参与配对错误修复的基因功能发生缺陷，因而不能正常的校正复制错误，引起微卫星的DNA发生改变，使其不能正常地发挥调控作用。MSI容易导致细胞增殖及分化异常，甚至促发恶性肿瘤形成。与正常组织相比，在肿瘤中的微卫星更容易导致微卫星长度发生改变。研究表明MSI与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等肿瘤发生密切相关。其中大约15％的散发性结直肠癌与MSI相关，90％以上的遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC，也称Lynch综合症)与MSI相关，因此对MSI检测在临床上具有重要意义。

检测微卫星不稳定性的方法一般通过选定特异的引物，然后PCR扩增样本中的微卫星位点，扩增后的产物经电泳检测(如毛细管电泳)后在显示系统中分析，并与正常组织作对照，判断微卫星位点的序列长度等有无改变。NCI(National Cancer Institute)推荐了5个微卫星位点作为MSI(微卫星不稳定性)检测的标准位点，分别为BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250。其中BAT25和BAT26具有单核苷酸重复序列，D2S123、D5S346和D17S250具有双核苷酸重复序列。检测后比较肿瘤和正常样本的检测结果，如果以上5个微卫星位点中有2个或2个以上微卫星位点发生变化，称为高频型(High-frequency MSI，MSI-H)；只有1个微卫星位点发生变化，称为低频型(low-frequency MSI，MSI-L)，5个均没有发生改变称为微卫星稳定型(Microsatellite stable，MSS)。

然而，传统的PCR扩增试剂对微卫星位点(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250)进行PCR扩增后，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物经电泳检测后荧光峰容易交叉重叠，因此较难在同一PCR体系中同时检测微卫星位点BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250是否发生变化。

发明内容

基于此，有必要提供一种PCR扩增后各个微卫星位点的扩增产物经电泳检测后产生的荧光峰不会交叉重叠，能够在同一PCR体系中同时检测微卫星位点BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250是否发生变化的检测微卫星不稳定性的多重荧光PCR扩增试剂及检测试剂盒。

一种检测微卫星不稳定性的多重荧光PCR扩增试剂，包括：

针对微卫星位点BAT25设计的上游引物BAT25-F1和下游引物BAT25-R1，所述上游引物BAT25-F1的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物BAT25-R1的碱基序列如SEQID No.2所示；