[发明专利]一种环状探针和基于环状探针捕获的测序文库构建方法

说明书

一种环状探针和基于环状探针捕获的测序文库构建方法，该方法包括：将环状探针与靶标核酸退火杂交，其中环状探针为线性核酸探针，其包括两个末端的特异性臂区和中间的通用序列，其中特异性臂区用于与靶标核酸杂交，杂交后探针的两个末端首尾相向，通用序列用于连接两个末端的特异性臂区并作为通用引物的识别区域；在聚合酶和连接酶的作用下，使环状探针的3’末端以靶标核酸为模板进行扩增并与5’末端连接形成环状分子；加入核酸外切酶将线性核酸分子消化。本发明利用扩增原理，解决捕获效率低和成本高昂的问题，利用环状探针解决引物对数量有限的问题，利用通用引物扩增解决多重扩增均一性差的问题。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种环状探针和基于环状探针捕获的测序文库构建方法。

背景技术

随着测序技术发展，第二代测序(NGS)迅猛发展，依靠着高通量的特点，成为了研究DNA和RNA的主要工具。在NGS中，人们可以同时对高达1亿条核酸序列进行同步的测序，在碱基上的通量到达了Gb的数量级，对整个基因组进行测序(WGS)也变得越来越常规。尽管在技术上可以做到WGS，但是测序时间和测序花销却是限制其应用的因素。通过对特定感兴趣区域进行捕获，既可以避免不需的序列信息占据结果中的大部分，降低所需数据量最终节省成本，也可以提高特定区域的测序深度，从而提供更有价值的信息。

对特定感兴趣区域进行捕获，现有主流技术方案有两种：NimbleGenSeqCap技术方案和Ampliseq技术方案。NimbleGenSeqCap技术方案，捕获对象为已经添加接头的文库，通过对目标区域设计长度为50-105bp的带标记线性探针，经杂交对目标区域片段进行富集，然后进行高通量测序。整个流程包括常规流程的文库构建、标记探针杂交、磁珠分离、目标文库洗脱、目标文库的二次扩增。Ampliseq技术方案，在建库之间对目标区域进行扩增，以增加对测序结果中目标区域的检出。技术针对每一个目标区域设计一对或多对引物，这些引物的扩增产物末端之间有重叠，使得每个区域对应的PCR产物可以覆盖整个区域。PCR之后，对PCR进行常规的NGS建库以及测序。由于经过了指数扩增，目标区域的核酸在总核酸中占的比例大大提升，因此能用于低频率突变的检测等应用。

NimbleGenSeqCap技术方案的缺点有以下几点：(1)捕获效率低，全外芯片平均捕获效率在50％-60％，小芯片捕获效率平均在40％；(2)芯片成本高昂，单个反应价格最低为1200元以上，加上洗脱试剂，单次试验成本大于1500元；(3)试验操作复杂繁琐，稳定性差，不利于产业化推广；(4)不适用较小区域的捕获，区域越小捕获效果越差。Ampliseq技术方案的缺点有以下几点：(1)多重PCR技术存在稳定性缺陷，不同引物扩增效率差异较大，不能有效反映不同靶标之间量的差异；(2)不适用于已经片段化样本，对片段化样本灵敏性大大降低；(3)复杂区域引物效率低下，很难捕获到；(4)PCR扩增循环数高，引入的PCR错误会影响低频检测。

发明内容

本发明提供一种环状探针和基于环状探针捕获的测序文库构建方法，具有高效、低成本、均一性好、简便快捷的优势。

根据第一方面，一种实施例中提供一种基于环状探针捕获的测序文库构建方法，包括：

将环状探针与靶标核酸退火杂交，其中上述环状探针为线性核酸探针，其包括两个末端的特异性臂区和中间的通用序列，其中上述特异性臂区用于与上述靶标核酸杂交，杂交后探针的两个末端首尾相向，上述通用序列用于连接两个末端的特异性臂区并作为通用引物的识别区域；

在聚合酶和连接酶的作用下，使上述环状探针的3’末端以上述靶标核酸为模板进行扩增并与5’末端连接形成环状分子；和

加入核酸外切酶将线性核酸分子消化。

进一步地，上述通用引物是带有测序接头的引物；上述核酸外切酶将线性核酸分子消化之后，加入上述通用引物进行PCR扩增。