[发明专利]蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测技术领域，尤其涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。

背景技术

美洲幼虫腐臭病(American foulbrood，AFB)是由幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae，P.larvae)引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，其典型症状为封盖后死亡的幼虫巢房盖变潮湿、下陷、颜色发暗并显油光，大部分巢房盖穿孔，挑取虫体可拉出长10cm～15cm的胶体状细丝，患病幼虫虫体变软，失去正常白色和光泽，逐渐变成淡褐色至棕黑色。这种芽孢杆菌有7层结构包围，特殊的结构使其极具生命力，在恶劣环境下仍可存活35年以上。AFB一旦在蜂场发生，极易造成幼虫死亡和蜂群群势衰弱，且很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。目前，AFB主要根据临床症状进行诊断，易造成误诊，实验室诊断主要是以病原形态学、病原分离培养、生理生化特征、PCR方法等，确诊需要4d～6d，而且由于P.larvae的生长需要复杂的营养，在普通培养基上不能萌发也不能形成芽孢。近年来，因荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点逐渐应用于各种病原体的定性和定量检测。Han等建立了P.larvae的微流体芯片定量PCR方法，该方法只需7.9min完成30个循环，即可检测出16S rRNA基因，并可以进行熔解曲线分析，此方法是目前世界上最快的实时荧光定量分析方法。Martinez等针对P.larvae 16S rRNA基因设计引物，建立了SYBR Green荧光定量PCR检测方法，该方法用时2h，最低可检出3.75个细菌/mL和10个芽孢/mL。已报道的上述两种荧光定量PCR方法中，微流体芯片定量PCR专用仪器设备、试剂、耗材昂贵，检测成本较高，目前还不利于普及和推广应用；SYBR Green荧光定量PCR虽检测成本低，但PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性，特异性较差。

综上所述，现有技术存在的问题是：

1.微流体芯片定量PCR检测速度快，但检测成本高，目前还不利于普及和推广应用；

2.SYBR Green荧光定量PCR检测成本低，但检测结果假阳性率高，特异性较差。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。

本发明是这样实现的，一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。具体的检测流程：

1.DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；

2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；

3.PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl₂(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH₂O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；

4.PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；

5.结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。

进一步，所述特异性引物的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

进一步，所述探针的序列为：SEQ ID NO：3。