[发明专利]蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。

2.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

3.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为：SEQ ID NO：3。

4.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法检测流程为：

DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；

对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；

PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl₂ 1.5μL，dNTPs 2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH₂O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；

PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；

结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。