[发明专利]构建待测基因组的DNA测序文库的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及构建待测基因组的DNA测序文库的方法及其应用。更具体地，本发明涉及构建待测基因组的DNA测序文库的方法、确定待测基因组的DNA序列信息的方法以及确定待测基因组三维空间结构的方法。

背景技术

近年来随着基因组学的发展，人类基因组计划成功绘制了人类基因组DNA序列图谱。人类基因组百科全书计划相关研究，分析发现了几万个基因，几十万个不同的基因调控元件。最近的研究表明，基因组的三维空间结构对基因组的表达、调控等功能有重要的影响。因此，如何获得不同细胞种类在不同细胞周期，在不同发育和分化阶段以及在正常细胞向疾病细胞转变的过程中基因组的三维结构信息成为了亟待解决的问题。而染色质构象捕获技术和二代测序技术的发展普及，使得基于二代测序的全基因组染色质构象捕获技术Hi-C(whole genome chromosome conformation capture)成为了研究染色体三维结构的重要手段。然而，全基因组染色质构象捕获技术极为受限于细胞数目，如果不能获得足够量的包含足够多有效连接事件的用于建库的DNA，是无法得到有效以及足够高分辨率的基因组三维结构信息的。

从而，如何建立不易获得的、少量数量类型细胞的DNA测序文库并有效用于DNA测序和获得足够高分辨率的基因组三维结构信息，是有待解决的问题。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题的发现而做出的：

传统的Hi-C技术反应体系较大，离心、洗涤、换管步骤繁多，在DNA扩增前进行片段大小选择会造成大量的DNA损失。而且DNA片段大小选择范围较窄，远远超过超声波打断对DNA片段的富集程度，进一步减少了用于二代测序的DNA量。以上的几点原因，造成了Hi-C技术通常用于研究容易获得的数量级在10⁷以上的常见类型细胞，对于处于胚胎发育早期的这种极难获得大量数目的细胞类型是无能为力的。基于发明人对以上传统技术问题的发现，发明人通过缩小反应体系、更改细胞转移方式、改变DNA片段大小选择的范围和时间等，创造性地提出了改进的全基因组DNA测序文库构建方法(在本申请中，简称为sisHi-C(small scale in situ Hi-C)技术)，该方法可以用来研究细胞数目低至10个的珍贵细胞类型，为研究胚胎早期发育的基因组三维结构建立和基因表达调控带来了希望。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建待测基因组的DNA测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用限制性内切酶对待测基因组进行消化处理，以便获得消化处理产物；(2)将所述消化处理产物进行生物素标记处理，以便获得生物素标记处理产物；(3)利用DNA连接酶对所述生物素标记处理产物进行连接处理，以便获得连接产物；(4)将连接产物进行解交联处理；(5)将解交联处理产物进行纯化处理；(6)将纯化处理产物进行超声和沉淀处理，所述沉淀处理是通过将超声处理产物与链酶亲合素磁珠进行接触进行的，以便获得结合有链酶亲合素磁珠的目标DNA片段；以及(7)基于结合有链酶亲合素磁珠的目标DNA片段，进行建库。利用根据本发明实施例的构建待测基因组的DNA测序文库的方法可以用来构建细胞数目低至10个细胞或基因组量低至50pg的DNA测序文库，进而实现不易获得的、少量数量类型细胞的基因组染色质构象的捕获。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是通过前面所述的构建待测基因组的DNA测序文库的方法获得的。利用根据本发明实施例的测序文库进行测序，可获得细胞数目低至10个的细胞或基因组量低至50pg的基因组序列信息和足够高分辨率的基因组三维结构信息。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种确定待测基因组的DNA序列信息的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：根据前面所述的方法构建待测基因组的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述待测基因组的DNA序列信息。利用根据本发明实施例的确定待测基因组的DNA序列信息的方法，可获得细胞数目低至10个的细胞或基因组量低至50pg的基因组序列信息。