[发明专利]提高数字PCR灵敏度的方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及基因检测领域，具体讲，涉及一种提高数字PCR灵敏度的方法及其试剂盒。本发明提高数字PCR灵敏度的方法至少包括以下步骤：在线性范围内同比例富集检测样本中的靶向核酸序列或待测基因突变位点的突变型基因序列和野生型基因序列，获得用于检测靶向核酸序列或待测基因突变位点的富集模板，用于数字PCR检测。本发明的方法显著改善了ddPCR对于检测样本痕量靶向核酸序列检出率低下，假阳性高的况状，大大提升了ddPCR的灵敏度及用于临床检测的价值。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体讲，涉及一种提高数字PCR灵敏度的方法及其试剂盒。

背景技术

数字PCR定量分析技术是通过将单个DNA分子分配到独立的反应室，使每个单元中只存在单个DNA分子，PCR扩增反应后，对阳性荧光信号进行检测，实现单分子的定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测等方面有着广泛应用前景。

数字PCR主要分为3种：微流体数字PCR(Microfluidic digital PCR，mdPCR)、微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)和芯片数字PCR(Chip digital PCR，cdPCR)。分别通过微流体通道、微液滴或微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可迚行单独的PCR反应，其中mdPCR基于微流控技术，对DNA模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附斱式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代；ddPCR技术，是相对成熟的数字PCR平台，利用油包水微滴生成技术，微滴经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测；cdPCR利用微流控芯片技术，将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上，利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增，实现绝对定量。

在人的外周血系统中不但含有自身游离的DNA(cell free DNA，cfDNA)，在肿瘤患者的外周血中也可含有循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA是原发肿瘤甚至是转移形成的新肿瘤上的肿瘤细胞破裂掉落到外周血循环系统中的DNA片段，因此ctDNA可以作为肿瘤诊断、药物疗效评估及预后的标志物。在孕妇外周血系统中不但含有自身游离的DNA，还可含有来自胎儿的游离DNA，检测孕妇外周血中胎儿的游离DNA，可用于胎儿遗传性疾病的诊断。如无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)是对母体外周血中胎儿游离DNA进行检测分析，可对胎儿进行非整倍体(21-三体、18-三体、13-三体及性染色体综合征)、性别鉴定、亲子鉴定、Rh基因、染色体片段异常、妊娠相关疾病及单基因病等的检测。

尽管ddPCR具有非常高的灵敏度，但是在遇到样本中的核酸为痕量时，通常还是难以检出。大大限制了ddPCR临床应用的价值。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种提高数字PCR灵敏度的方法。

本发明的第二发明目的在于提出用于提高数字PCR灵敏度的试剂盒。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

根据本发明的第一发明目的，本发明提出提高数字PCR灵敏度的方法，至少包括以下步骤：在线性范围内同比例富集检测样本中的靶向核酸序列或待测基因突变位点的突变型基因序列和野生型基因序列，获得用于检测所述靶向核酸序列或所述待测基因突变位点的富集模板，用于进行所述数字PCR检测。

根据本发明的第二发明目的，本发明提出一种提高数字PCR灵敏度的试剂盒，其中含有用于扩增待检测样本中的靶向核酸序列或待测基因突变位点的突变型基因序列和野生型基因序列。