[发明专利]一种荔枝霜疫霉PCR引物及其分子检测方法

说明书

本发明公开了一种荔枝霜疫霉PCR引物及其分子检测方法，专用于荔枝霜疫霉特异检测，主要采用一种荔枝霜疫霉菌的PCR引物（PlRhF：CTCGAAAGGCTAATCCGAATG；PlRhR：ACGGCACTCTTCAGGCTCTT）经过聚合酶链式反应扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到大小为340 bp左右的单一形带。所发明的PCR引物及其用法可被用于生产实践中荔枝霜疫霉菌感染的植株和采摘后荔枝果实中荔枝霜疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种荔枝霜疫霉菌PCR引物及其快速检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间荔枝霜疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

荔枝（Litchi chinensis）是我国南方的一种名特优水果，栽培面积和年产量分别占世界的84.5 %和70.5 %，年总产值达到62.88亿元，为我国在世界上最具竞争实力的一种亚热带与热带水果。荔枝霜疫病目前是荔枝生产一种最重要的病害，其是由荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）侵染引起的。它主要危害已近成熟的果实，也为害花穗、幼果、果柄、结果小枝和叶片，从而引起大量落花、落果、裂果及烂果，同时也是造成荔枝采后腐烂变质的重要因素。天气潮湿年份烂果率高达50 %，损失率高达30 %～80 %，严重影响荔枝产量和鲜果品质，造成严重的经济损失。近几年该病有逐渐加重的趋势，已成为限制荔枝安全生产的重要障碍。因此建立荔枝霜疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及采摘果实进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况，及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失，尤其是荔枝采后储藏都具有重要的理论和实际意义。

传统荔枝霜疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。因此，建立一套快速、灵敏、准确的荔枝霜疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定、变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原菌检测重要的技术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等。目前，病原菌分子检测主要以ITS核酸序列作为靶标，但是ITS序列在不同物种间很保守，尤其在相近物种间差异更小，因此特异性不高是其缺陷。因此，寻找物种所特异的核酸序列用于病原菌的分子检测是非常有必要的。此核酸序列可应用于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种荔枝霜疫霉菌高度特异的PCR检测引物以及建立了基于琼脂糖凝胶电泳判定的PCR检测。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．PCR引物的设计

通过比较基因组学的方法，在荔枝霜疫霉的基因组上选择有卵菌特异性的基因PlRh（Gene ID：Pl_101565）作为检测靶标，采用Primer Premier 6软件设计一种PCR检测引物，引物序列为：

PlRhF：CTCGAAAGGCTAATCCGAATG；