[发明专利]一种干酪乳杆菌来源的L‑乳酸脱氢酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌来源的L-乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(Phenyllactate acid，PLA)，系统名为2-羟基-3-苯基丙酸，是一种高值有机酸，其具有两种对映异构体：L-PLA和D-PLA。PLA的分子式为C₉H₁₀O₃，相对分子质量为166.17，其性质稳定，熔点为121～125℃；PLA在水中溶解度较好，并且其在水溶液中有较好的热稳定性。L-PLA和D-PLA都具有广谱抑菌效果，可作为天然抑菌剂，替代化学合成的防腐剂，而且可经聚合反应合成聚苯乳酸新型高分子材料，替代聚乳酸高分子材料。因此，苯乳酸在化工、制药、生物、材料和食品等领域有广阔的应用前景。

PLA可由多种微生物代谢产生，是菌体在代谢途径中一个副产物，如大多数的乳酸菌如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)等，也有一些真菌如白地霉(Geotrichum candidum)，荧光维克酵母(Wickerhamiafluorescens)TK1可产PLA，但现有的野生菌株自产PLA的浓度很低。目前，PLA可以通过化学和生物的方法合成，但由于化学方法苛刻的反应条件、复杂的技术路线、副产物多不易分离，尤其对环境造成污染等缺点，生物合成法因其高效性，反应条件温和等优点，近年来受到广大研究者的青睐。

已有研究表明，微生物中多种L-乳酸脱氢酶可不对称还原苯丙酮酸生成L-PLA，但是不同L-LDH不对称还原苯丙酮酸的能力存在明显差异，如贾江花等克隆表达了来源于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中的L1-LDH和L2-LDH基因，重组L1-LDH对苯丙酮酸的比活力为71.06U/mg，而重组L2-LDH对苯丙酮酸的比活力仅为0.06U/mg，并未测定其对映体纯度。王颖等克隆了来源于Bacillus megaterium Z2013513的ldhL基因并在大肠杆菌中实现表达，测得粗酶液对苯丙酮酸的酶活力为3.4U/mg。在37℃、200r/min条件下，25g/L(干重)重组菌经60min将70.32mmol/L苯丙酮酸全细胞转化合成50.59mmol/L L-PLA，ee_p为96.89％，底物摩尔转化率仅为71.94％。因此，利用分子生物学手段不断挖掘出性状优良的L-LDH，对于获得高纯度，高产量的L-PLA具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的L-乳酸脱氢酶，LcLDH1，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述L-乳酸脱氢酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.1所示的L-乳酸脱氢酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-22b(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

本发明的第四个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-22b(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供生产所述乳酸脱氢酶的方法，是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.3～0.5mmol/L的IPTG诱导6～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在18～22℃进行诱导。

本发明的第六个目的是提供所述L-乳酸脱氢酶的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以苯丙酮酸为底物，加入所述L-乳酸脱氢酶，转化生产L-苯乳酸。