[发明专利]单色多重定量PCR

权利要求书

1.一种用于测定第一靶核酸和第二靶核酸的拷贝数的方法，包括：

a)将第一靶核酸和第一引物组并将第二靶核酸和第二引物组接触，并且加入单一检测标记以形成均一体系的反应混合物，其中所述第一引物组的引物之一被阻止引发所述第一靶核酸并且被阻止引发所述第一靶核酸的引物在其3’端包含错配碱基，其中所述第一靶核酸序列的拷贝数比所述第二靶核酸序列的拷贝数多；

b)通过聚合酶链式反应用第一引物组扩增第一靶核酸以形成具有第一解链温度的第一扩增子，以及通过聚合酶链式反应用第二引物组扩增第二靶核酸以形成具有第二解链温度的第二扩增子，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度高；

c)在聚合酶链式反应期间，在第一信号采集温度测定所述检测标记的量，其中所述第一信号采集温度是低于所述第一解链温度；

d)在聚合酶链式反应期间，在第二信号采集温度并测定所述检测标记的量，其中所述第二信号采集温度高于所述第一解链温度且低于所述第二解链温度；

e)重复步骤(b)至(d)至少一次；以及

f)测定所述第一靶核酸相比于所述第二靶核酸的相对拷贝数；

其中在每个所述扩增步骤中均在所述第一信号采集温度和所述第二信号采集温度检测所述检测标记的量；

其中所述第一解链温度与所述第二解链温度之间的差为至少4摄氏度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二引物组中的至少一个引物在所述引物的5’端包含GC-钳。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物组的引物的3’端是彼此互补的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一引物组的一个引物是包含至少一个与该引物的3’端相邻的错配核苷酸的错配引物，其中所述核苷酸与所述靶核酸是不互补的，但是与所述第一引物组中的另一个引物的3’端核苷酸是互补的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一引物组的错配引物的延伸产物能与所述第一引物组中的另一个引物杂交。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测标记是嵌入染料。

7.根据权利要求1所述的方法，其中第一靶核酸和第二靶核酸的拷贝数度量所述第一核酸相比于所述第二核酸的相对量。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一靶核酸包含串联重复序列。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一靶核酸获自样本。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一靶核酸的拷贝数确定存在于样本中的串联重复序列的数量。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶链式反应包括至少三个连续阶段的循环，其中所述聚合酶链式反应的第一阶段的循环包括其中聚合酶链式反应的退火温度高于第二阶段的循环的退火温度的聚合酶链式反应，其中所述聚合酶链式反应的第二阶段的循环包括其中聚合酶链式反应的退火温度低于第一阶段的循环的退火温度的聚合酶链式反应，并且其中所述聚合酶链式反应的第三阶段的循环包括其中聚合酶链式反应的退火温度低于第一阶段的循环的退火温度但高于第二阶段的循环的退火温度的聚合酶链式反应。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述聚合酶链式反应的第一阶段的循环期间仅形成第一扩增子。

13.根据权利要求11所述的方法，其中在所述聚合酶链式反应的第二阶段的循环期间仅形成第二扩增子。

14.根据权利要求11所述的方法，其中在所述聚合酶链式反应的第三阶段的循环期间形成第一扩增子和第二扩增子。