[发明专利]使用表达Cre依赖的Cas9基因的哺乳动物进行基因修饰和疾病建模的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因修饰的哺乳动物，且尤其涉及使用表达Cre依赖的Cas9基 因的哺乳动物进行基因修饰和疾病建模的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9系统已经成为一种强大的基因组编辑技术，可以在结合Cas9与多 个单链向导RNA(sgRNAs)的原核和真核基因组中实现可遗传的多基因变化。此 系统已被改进以促进在许多种动物内进行精确的基因组编辑。基因编辑动物的制 备主要是基于胚胎注射或体细胞核转移方法，这类方法成本高昂且较为耗时。直 接体内基因编辑将克服这些问题。人们早期为体内基因编辑而作出的努力是，通 过流体动力注射或原位注射，将具有Cas9基因和sgRNAs的载体直接递送入成年 小鼠的选定组织，并且成功实现特定和多重基因修饰。然而，编辑效率较低，这 是因为这种方法是由慢病毒或腺病毒群(AAV)介导的，其很难引入大小为4.2kb 如SpCas9核酸内切酶这样大的基因至体细胞内。

发明内容

本发明的实施方案涉及转基因猪类动物，其基因组包含的多核苷酸序列包括 编码Cas9的多核苷酸，在彼此的取向上倒置的第一对loxP序列，以及在彼此的 取向上倒置的第二对loxP序列。在一些实施例中，第一对是与第二对loxP序列 不相容的loxP序列，并且编码Cas9的多核苷酸处于反转录方向。

本发明的一些实施例涉及一种制备如上所述的转基因猪类动物的方法。所述 方法可包括：提供多核苷酸序列，并将该多核苷酸序列引入转基因猪类动物的基 因组，以制备转基因猪类动物。

本发明的一些实施例涉及一种在如上所述的转基因猪类动物细胞中体内或 体外地产生一种或多种基因序列改变的方法。所述方法可以包括将载体递送至猪 类动物的细胞，并且所述载体可包含编码Cre重组酶的第一种多核苷酸和对应于 体内CRISPR-Cas复合物RNA的第二种多核苷酸，以使得所述CRISPR-Cas复合物 RNA形成Cas9和向导RNA复合物，其导致猪类动物中基因序列的表达改变。

本发明的一些实施例涉及一种检测试剂对肿瘤细胞的治疗效果的方法。所述 方法可包括，将载体递送至如上所述的猪类动物的细胞中。所述载体可包括编码 Cre重组酶的第一种多核苷酸和对应于体内CRISPR-Cas复合物RNA的第二种多 核苷酸，以使得所述CRISPR-Cas复合物RNA形成Cas9和向导RNA复合物，其导 致猪类动物中基因序列的表达改变。所述基因序列的表达改变可导致来自猪类动 物细胞的肿瘤细胞的发展。所述方法还可包括，将待检测的一种或多种试剂施用 于所述肿瘤细胞，并确定，由于一种或多种试剂的施用，肿瘤细胞的物理或生物 化学特征是否已经改变。

在一些实施例中，所述第二对loxP序列是突变的loxP序列。

在一些实施例中，所述第二对loxP序列包含loxP 2272序列。

在一些实施例中，所述第一对loxP序列和所述第二对loxP序列被布置成使 得翻转所述第一对loxP序列或翻转所述第二对loxP序列导致在第一对loxP序 列的5'loxP序列和第二对loxP序列的5'loxP序列之间的序列的切除。

在一些实施例中，所述多核苷酸序列位于猪Rosa26基因座中。

在一些实施例中，所述多核苷酸序列位于猪Rosa26基因座的外显子1和外 显子2之间。

在一些实施例中，所述多核苷酸序列以5'-3'的顺序包含SEQ ID NO：6， SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

在一些实施例中，所述多核苷酸序列以5'-3'的顺序包含SEQ ID NO：2， SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO： 6的核苷酸序列。

在一些实施例中，通过使用转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，所述多核 苷酸序列可被引入转基因猪类动物的基因组。

在一些实施例中，Cre重组酶为它莫西芬诱导的Cre重组酶，以使得Cas9蛋 白在猪类动物细胞中的表达水平随着它莫西芬浓度的增加而升高。

在一些实施例中，所述载体包括：慢病毒，AAV或腺病毒。

在一些实施例中，所述表达改变包括致癌染色体重排。