[发明专利]使用表达Cre依赖的Cas9基因的哺乳动物进行基因修饰和疾病建模的方法

权利要求书

1.一种转基因猪类动物，其基因组包含一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含：编码Cas9的多核苷酸，彼此取向相反的第一对loxP序列，以及彼此取向相反的第二对loxP序列；其中，所述第一对loxP序列是与所述第二对loxP序列不相容的loxP序列，并且，所述编码Cas9的多核苷酸处于反转录取向。

2.一种制备如权利要求1所述的转基因猪类动物的方法，所述方法包括：

提供所述多核苷酸序列；并且

将所述多核苷酸序列引入所述转基因猪类动物的基因组，从而制备所述转基因猪类动物。

3.一种在如权利要求1所述的转基因猪类动物的细胞中体内或体外地产生一种或多种基因产物的表达改变的方法，所述方法包括：

将载体递送至猪类动物的细胞，所述载体包含编码Cre重组酶的第一种多核苷酸和对应于体内CRISPR-Cas复合物RNA的第二种多核苷酸，以使得所述cas9蛋白和向导RNA形成CRISPR-Cas复合物，其导致猪类动物的基因组序列改变。

4.一种检测试剂对肿瘤细胞的治疗效果的方法，所述方法包括：

将载体递送至如权利要求1所述的转基因猪类动物的细胞中，所述载体包括编码Cre重组酶的第一种多核苷酸和对应于体内CRISPR-Cas复合物RNA的第二种多核苷酸，以使得所述cas9蛋白和向导RNA形成CRISPR-Cas复合物，其导致猪类动物的基因组序列改变；所述基因组序列改变导致来自猪类动物细胞的肿瘤细胞的发展；

将待检测的一种或多种试剂施用于所述肿瘤细胞，并且

确定：由于一种或多种试剂的施用，所述肿瘤细胞的物理或生物化学特征是否已经改变。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述第一对loxP序列是突变的loxP序列。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述第二对loxP序列包含loxP 2272序列。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述第一对loxP序列和所述第二对loxP序列被布置成使得翻转所述第一对loxP序列或翻转所述第二对loxP序列导致在所述第一对loxP序列的5'loxP序列和所述第二对loxP序列的5'loxP序列之间的序列的切除。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述多核苷酸序列位于猪Rosa26基因座中。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述多核苷酸序列位于猪Rosa26基因座的外显子1和外显子2之间。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述多核苷酸序列以5'-3'的顺序包含SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述多核苷酸序列以5'-3'的顺序包含SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述多核苷酸序列以5'-3'的顺序包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因猪类动物，其中，所述多核苷酸序列以5'-3'的顺序包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

14.根据权利要求2所述的方法，其中，将所述多核苷酸序列引入所述转基因猪类动物的基因组的步骤包括：

通过使用转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，所述多核苷酸序列被引入所述转基因猪类动物的基因组。