[发明专利]一种γδT细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种γδT细胞培养方法。

背景技术

γδT细胞是一类分布于外周血及粘膜组织的非MHC限制性固有T淋巴细胞，γδT细胞被认为是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型，占CD³⁺T细胞的1％～5％，大部分γδT细胞不表达CD4、CD8分子，有特异性识别抗原功能而无MHC限制，并在机体抗感染和自身免疫疾病及抗肿瘤等过程中起重要作用。

在人体的外周血中均能分离得到γδT细胞。在大肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中亦分离得到γδT细胞。γδT细胞不仅能杀伤自体肿瘤细胞，还能杀伤异体肿瘤细胞，但对正常细胞无毒性。

现有γδT细胞培养技术是直接分离外周血中的单个核细胞(PBMC)，然后将PBMC细胞在含有一定浓度的IL-2的培养基中与肿瘤细胞混合培养2周，得到10⁹的细胞，并将其作为细胞制剂，运用于机体保健或临床。

现有技术主要采用IL-2和肿瘤细胞共同刺激单个核细胞，使细胞进行扩增。其缺点主要是细胞扩增倍数相对较低，纯度相对较低，且存在肿瘤细胞无法完全与γδT细胞分开等风险。

发明内容

有鉴于此，本发明公开了一种γδT细胞培养方法，本发明将将高密度细胞培养瓶进行改造，然后将分离得到的单个核细胞采用IL-2进行诱导，培养γδT细胞，并且采用肿瘤细胞裂解后的内容物来致敏γδT细胞，使γδT细胞的扩增效果得到增强，且其杀伤活性也大大增强。

本发明公开的γδT细胞培养方法包括以下步骤：

1)收集外周血，离心分离得到外周血单个核细胞；

2)对步骤1)分离得到的外周血单个核细胞进行诱导培养；

3)制备肿瘤细胞裂解内容物，将所述肿瘤细胞裂解内容物与步骤2)的产物进行共培养；

4)对步骤3)的产物进行检测。

优选地，步骤2)所述的诱导培养为：

将步骤1)分离得到的细胞以一定密度加入到X VIVO-15培养基，并往培养基中加入浓度为50-500μg/mL的OKT-3和浓度为100-1000U/mL的IL-2。

在本发明提供的实施例中，X VIVO-15培养基购至瑞士LONZA公司。

作为优选，诱导培养的条件为37℃，二氧化碳含量为5％的二氧化碳培养箱。

作为优选，诱导培养采用高密度细胞培养瓶进行培养。

在本发明提供的实施例中，高密度细胞培养瓶购至美国CELLLINE公司。

在本发明中，高密度细胞培养瓶为一种双室细胞培养瓶，主要模拟生物反应器进行细胞培养。

在本发明中，肿瘤细胞裂解内容物为K562细胞经过反复冻融离心后的上清液。

优选地，肿瘤细胞裂解内容物的制备方法为：将肿瘤细胞K562从培养箱中拿出来，迅速放入-196℃的液氮中30分钟。从液氮中拿出来使劲摇晃，直到完成融解。再放入-196℃的液氮中。如此反复3-5次，直到肿瘤细胞完全破裂，细胞内容物完全释放出来。然后将细胞内容物进行离心，5000rpm10分钟，收集上清液即为肿瘤细胞裂解内容物。用BCA法检测内容物的蛋白浓度，得蛋白浓度为62.4μg/mL。

相比于现有技术，本发明公开的γδT细胞培养方法具有以下优点：

1、本发明专利主要采用改造后的高密度细胞培养瓶，在添加IL-2的情况下诱导培养γδT细胞，使γδT细胞的扩增效果得到增强，且所用培养基减少，继而降低了生产成本；

2、本发明专利采用肿瘤细胞裂解后的内容物刺激γδT细胞，使其杀伤活性大大增强，且规避了γδT细胞终仍混有辐照后的肿瘤细胞的风险。

附图说明

图1示培养2周后γδT细胞的形态(100倍)，其中1-1为对比例1培养的γδT细胞，1-2为实施例1培养的γδT细胞；

图2示培养2周后γδT细胞的流式检测结果；其中2-1～2-7分别为实施例1-6、对比例1培养的γδT细胞流式检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种γδT细胞培养方法。

下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。

实施例中使用的试剂和组分均为市售或自制来源。