[发明专利]硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用

说明书

本发明公开了硝基还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用。一种硝基还原酶基因lnr，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长为609bp，编码202个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。LNR能催化还原二甲戊灵苯环C‑6位上的硝基基团生成2‑硝基‑6‑氨基‑N‑(1‑乙基丙基)‑3,4‑二甲苯胺，也能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵苯环上两个对称的硝基基团，但它的催化效率明显高于PNR。LNR具有更广谱的底物谱，在消除硝基芳烃除草剂残留引起的环境污染修复方面具有更广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于环境微生物和农业领域，涉及降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的硝基 还原酶基因lnr及其编码的蛋白和应用。

背景技术

随着对粮食产量要求的提高，在世界范围内的化学除草面积也逐渐扩大，除草剂的施用量 也居高不下。除草剂的使用可减轻农业劳动强度、保证农业正常生产甚至高产，但是长期以来 大量除草剂的使用也不可避免地产生了负面影响：土壤、地下水和空气中的农药污染；在某些 作物中残留；对人体健康的潜在危害。大量研究表明微生物降解是农药在环境中消失的最主要 因素，且微生物降解修复技术是一种原位生物修复技术，效果好，费用低，无二次污染，适合 大面积污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。

二硝基苯胺类除草剂是一类优秀的旱田作物选择性除草剂,在化学除草中占有重要地位， 主要品种包括二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵。它们具有广谱的除草活性，应用范围广、 用量大，在土壤中具有中度持久性，半衰期为2-3个月。据相关资料显示，在美国近几年的大 豆除草剂施用种类调查中，二甲戊灵和氟乐灵的使用量仅次于草甘膦。现已发现该类除草剂的 残留对生态环境、水生生物及人体健康都有潜在危害。

目前，国内外已筛选到很多能降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的细菌和真菌菌株， 并利用HPLC、GC和MS等方法鉴定了降解中间产物，并根据中间产物的鉴定推测了微生物降 解的部分代谢途径。研究表明微生物降解二硝基苯胺类除草剂的主要方式有氧化N端脱烷基和 硝基还原作用，但至今微生物降解二硝基苯胺类除草剂的全过程还不清楚，且参与其中的降解 基因/酶还鲜有报道。Bacillus subtilis Y3是一株二甲戊灵高效降解菌株，采用HPLC-MS/MS鉴 定了菌株Y3降解二甲戊灵生成的中间产物为2-硝基-6-氨基-N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲苯胺(6- 氨基二甲戊灵)。对菌株Y3基因组框架图进行分析发现，菌株Y3中有很多nitroreductases-like的 orfs，因此不采用异源表达的方法分别对各个基因进行功能鉴定，转而通过菌株粗酶液蛋白纯 化的方法获得了二甲戊灵硝基还原酶PNR。PNR是首个报道的二甲戊灵硝基还原酶，同时它还 能催化还原仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的两个硝基基团。

获得二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵降解代谢菌株和降解基因/酶在治理其残留，消 除其药害中具有以下作用：(1)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性 转基因作物；(2)通过现代微生物发酵技术将降解菌株和基因制成降解菌剂或酶制剂实现土壤 原位修复。终上所述，二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的降解基因/酶在消除该类除草剂 药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有研究的不足，提供一种降解二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵 硝基还原酶基因。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

一种硝基还原酶基因lnr，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明所述的硝基还原酶基因lnr编码的硝基还原酶LNR，氨基酸序列为：SEQ IDNO.2。

含有本发明所述的硝基还原酶基因lnr的重组表达载体。

含有本发明所述的硝基还原酶基因lnr的基因工程菌。