[发明专利]一种磁分离RCA合成DNA酶检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁分离RCA合成DNA酶检测金黄色葡萄球菌的方法，属于食品安全技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)大量存在于自然界中，是一种典型的球型革兰氏阳性菌。金葡菌对生长环境要求不严，肉类、鱼类、乳制品等绝大多数食品都可为其提供良好的生长条件，在适宜的温度下，可产生耐高温的肠毒素从而引发食物中毒。我国每年发生大量由金葡菌引起的食物中毒事件，其主要表现症状为呕吐和腹泻。因此，对金葡菌作出快速、精确的检测十分重要。

传统检测金葡菌的方法为根据国标法对其进行分离培养和生化鉴别，存在检测耗时、操作繁琐、检测限高等缺点，无法达到现今食品中微生物安全性的要求。随着生物技术的快速发展，许多新型快速检测技术得到了广泛的研究和应用，如PCR技术、免疫学技术、生物传感器和基因芯片技术等。

滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)是近几年发展起来的一种等温条件下的DNA复制技术，以短寡核苷酸链为引物，线性单链DNA序列形成环状模板，运用具有链置换作用的DNA聚合酶使引物生成包含若干串联重复序列互补环状模板的线性长链DNA分子。RCA具有操作简单、高特异性、扩增效率高、产物稳定等优点。DNA酶是一段能形成G-四链体的核苷酸序列结合氯化血红素后模拟过氧化物酶功能的复合物，可催化H₂O₂与鲁米诺的化学发光反应。滚环扩增合成DNA酶，结合了滚环扩增的信号放大作用和DNA酶的催化作用，双重放大。

近年来，许多研究将DNA夹心杂交原理结合纳米材料应用于致病菌的检测，但其中也存在着一些检测限高、灵敏度低和操作复杂等问题。因此，有必要建立一种检测限低、灵敏度高且操作简单的检测金黄色葡萄球菌的方法。

发明内容

为了解决目前存在的金黄色葡萄球菌检测限高等问题，本发明提供了一种磁分离滚环扩增合成DNA酶检测金黄色葡萄球菌的方法。本发明方法，将金黄色葡萄球菌的16S rDNA为一段特异性检测的目标DNA片段，使用特异性探针修饰的磁纳米粒子来结合和分离金葡菌的16S rDNA，不仅利用磁纳米粒子的磁性分离作用，还利用探针和金葡菌16S rDNA间特异性的互补配对作用，从而快速地从复杂组分中分离金葡菌16S rDNA，并有效结合滚环扩增技术合成的DNA酶催化H₂O₂-鲁米诺反应系统来实现信号的双重放大和检测。

本发明利用DNA夹心杂交原理设计了两条特异性的探针——捕获探针和信号探针。将捕获探针修饰到磁纳米粒子表面，该材料可快速地从复杂组分中结合和分离金黄色葡萄球菌的目标DNA序列，再加入包含滚环扩增引物的信号探针与目标DNA序列互补杂交形成夹心结构，然后滚环扩增引物与相应包含DNA酶互补序列的模板互补配对引发滚环扩增反应合成DNA酶，利用DNA酶进行催化H₂O₂-鲁米诺化学发光反应系统，根据相对发光值的变化来定量检测金葡菌。在一定范围内，金黄色葡萄球菌的浓度与相对发光值的变化呈线性相关，可达到对金黄色葡萄球菌定量检测的目的。

本发明方法，包括如下步骤：

(5)先将捕获探针与亲和素修饰的磁纳米粒子(Avidin-MNPs)混匀、孵育，使捕获探针修饰到磁纳米粒子表面，得到捕获探针功能化的磁纳米粒子；所述捕获探针功能化的磁纳米粒子能够结合金黄色葡萄球菌的目标DNA序列；

(6)将捕获探针功能化的磁纳米粒子与含目标DNA序列的待测液孵育，然后加入信号探针，使目标DNA序列与捕获探针、信号探针生成夹心结构；所述信号探针上包含滚环扩增引物；

(7)加入滚环扩增模板，然后滚环扩增引物与相应包含DNA酶互补序列的模板互补配对引发滚环扩增反应合成DNA酶；

(8)利用DNA酶进行催化H₂O₂-鲁米诺化学发光反应系统，根据相对发光值的变化来定量检测金黄色葡萄球菌。

在一种实施方式中，所述方法还包括先配制一定含有不同浓度的目标DNA序列的标准样品，建立不同浓度的目标DNA序列与相对发光值的标准曲线，当检测待测样品时，将利用待测样品得到的相对发光值代入到标准曲线中，即得到待测样品中的目标DNA序列的浓度。

在一种实施方式中，所述目标DNA序列为CCT TTG ACAACT CTA GAG ATA GAG CCT TC(如SEQ ID NO:1所示)。