[发明专利]一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法

说明书

本发明公开了一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶‑磷脂微囊制备方法，包括以下步骤：S1、磷脂微粒的制备：(1)把40mg丙酮洗过的大豆磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％；(2)冰上超声波处理；S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：(1)准备酶溶液；(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％；(3)加入S1得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；(4)在冰上孵育30分钟；(5)在冰上进行过夜透析。本方法形成的是大单层微囊，其体积大，并且具有良好的稳定性，膜的流动性好，有利于膜酶蛋白的嵌入，适合于研究各种膜酶的活性和功能。

技术领域

本发明涉及膜酶活性科研实验研究技术领域，具体是涉及一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法。

背景技术

生物细胞尤其是真核生物细胞有发达的生物膜(biomembrane)系统。生物膜是镶嵌有蛋白质和糖类的磷脂双分子层。真核细胞除质膜(又称细胞膜)外，还有分隔各种细胞器的膜系统，包括核膜、线粒体膜、内质网膜、溶酶体膜、高尔基体膜、叶绿体膜、液泡膜、过氧化酶体膜等。生物膜形态上都呈双分子层的片层结构，厚度约5～10纳米。生物膜起着划分和分隔细胞和细胞器的作用，也是与许多能量转化和细胞内通讯有关的重要部位，同时，生物膜上还有大量的酶结合位点。不同的生物膜具体作用又各不相同。

1965年，英国学者Bangham A D把磷脂分散到过量水中，形成了一种由双分子膜组成的闭合磷脂微囊，这一发现开创了新的研究领域。人工磷脂微囊具有类似于生物膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间，这种类膜结构使其能够包裹多种物质。人工模拟生物膜有利于研究其功能，例如各种物质穿过膜的机理、生物膜上的各种蛋白质和糖类的功能。在医学上，人工生物膜微囊可以作为药物的载体，携带药物进入细胞，该进药方式具有靶向、长效、低毒、缓释、无免疫原性及保护包封药物的优点。另外，人工磷脂微囊还可以作为基因转染载体，还可以用于免疫学检测等。

发明内容

本发明解决的技术问题是：以往的人工磷脂微囊形成方法往往技术复杂，所形成的磷脂微囊小，不利于将酶蛋白嵌入到微囊膜上。从而提供了一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法。

本发明的技术方案是：

一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，主要包括以下步骤：

S1、磷脂微粒的制备：

(1)把40mg丙酮洗过的磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度27～28℃；

(2)冰上超声波处理5分钟，超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；

(3)静置5分钟后，再超声处理5分钟；

S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：

(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为1～2mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融3～5次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；

(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度27～28℃；

(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；

(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入5.0～10.0％海藻酸钠与4.5～6.0％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为0.5～3％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为0.3～2％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育30～50min；

(5)在冰上或冷室中透析4小时，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；

(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液，透析过程中不断搅拌；