[发明专利]一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法

权利要求书

1.一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

S1、磷脂微粒的制备：

(1)把40mg丙酮洗过的磷脂，悬浮在1ml缓冲液中，并加入胆酸钠至终浓度为2％，过程中控制温度27～28℃；

(2)冰上超声波处理5分钟，超声处理时，要不断的通入氩气，以保证无氧环境；

(3)静置5分钟后，再超声处理5分钟；

S2、酶蛋白质嵌入磷脂微囊：

(1)准备酶溶液300μl，其中酶蛋白含量为1～2mg/ml；将所述酶溶液置于-60℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融3～5次，每次冻融后均用匀浆机高速匀浆处理；

(2)往酶溶液中加胆酸钠溶液至终浓度为0.5％，过程中控制温度27～28℃；

(3)加入S1制备得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的质量比为1:40；

(4)在冰上孵育30分钟；向孵育后的溶液中加入质量百分浓度为5.0～10.0％海藻酸钠与质量百分浓度为4.5～6.0％二硫苏糖醇混合溶液，最终使海藻酸钠的质量百分浓度为0.5～3％，二硫苏糖醇的质量百分浓度为0.3～2％，颠倒混匀后再置于冰上进行二次孵育30～50min；

(5)在冰上或冷室中透析4小时，透析液体积为酶溶液体积的100倍，透析过程中不断搅拌；

(6)用200倍体积的缓冲液继续过夜透析，中间更换一次透析液；

(7)用光学显微镜或电子显微镜检查微囊的大小；

(8)除菌，4℃密封保存。

2.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述磷脂为大豆磷脂(asolectin)。

3.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述缓冲液为pH为7.0、浓度为0.02～0.04mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，或者pH为7.4、浓度为50mM的磷酸缓冲液，或者pH为7.3、浓度为100mM的Hepes-KOH缓冲液。

4.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(2)所述的冰上超声波处理具体操作为：将溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理；处理过程如下：探头插入液下1.3cm，液面高度保持6～10cm，脉冲时间为5～8s，占空比为40％～70％，温度8～26℃，声强150.22～672.34W/cm²。

5.如权利要求4所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(2)所述的超声波处理是以每超声10～13s，间歇2～5s的方法间歇超声处理共5分钟。

6.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S1中(3)所述的超声处理是以每超声10～13s，间歇2～5s的方法间歇超声处理共5分钟。

7.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S2中(4)所述的二次孵育期间每隔5～10min混匀一次。

8.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S2中(5)所述的透析液与步骤S1中(1)所述缓冲液相同。

9.如权利要求1所述的一种利于膜酶镶嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制备方法，其特征在于，步骤S2中(5)和(6)所述的透析过程中透析袋的透过分子量为8000～14000之间。