[发明专利]7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在熊脱氧胆酸合成中的应用

说明书

本发明公开了一种通过分子进化获得的活性和稳定性提高的7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体、含有7β‑羟基甾醇脱氢酶突变基因的重组表达质粒及重组表达转化子、重组突变体酶制剂的制备方法，以及该重组突变体酶制剂在熊脱氧胆酸合成中的应用。本发明的7β‑羟基甾醇脱氢酶具有出色的活性和热稳定性，可以高效催化7‑羰基石胆酸不对称还原制备熊脱氧胆酸；将本发明所述的7β‑羟基甾醇脱氢酶固定化后与固定化7α‑羟基甾醇脱氢酶酶法耦联，可以直接催化廉价底物鹅脱氧胆酸的差向异构，连续转化制备熊脱氧胆酸，操作简便。与现有报道相比，本发明的羟基甾醇脱氢酶催化制备熊脱氧胆酸，具有底物浓度高、反应时间短、反应完全，产品纯度高的优势，有很强的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及活性和稳定性提高的扭链瘤胃球菌7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenase，7β-HSDH_Rt)突变体、其重组表达载体以及重组表达转化子，重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂的制备方法，以及重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂在熊脱氧胆酸合成中的应用。

背景技术

熊胆汁制品具有很高的药用价值，在现代医学中通常用于治疗反流性胃炎、胆结石、胆源性胰腺炎、脂肪性肝病、药物性肝炎以及病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。熊脱氧胆酸(简写为UDCA)是熊胆汁制品中的重要有效成分，具有很高的药用价值，可改善慢性肝病的损害，在急性和慢性肝炎治疗中的应用正在扩大。UDCA在熊的胆汁中含量最高，而在其他动物的胆汁中含量很少。目前UDCA大部分是从人工养殖的熊的胆汁中提取，产量低，来源有限，并且直接从活熊身上抽取胆汁有悖于动物保护。如果以其他动物胆汁来源的，可大量获得的胆酸(CA)或者UDCA的差向异构体鹅脱氧胆酸(CDCA)作为底物，采用酶法或者化学-酶结合的方法，人工合成具有较高价值的UDCA，减少对天然熊胆汁的需求，将具有重要的经济、社会价值和生态意义。

早期研究中，以牛、羊胆汁来源的CA为原料，经甲酯化、二乙酰化、12位羟基氧化、黄鸣龙还原合成CDCA，进而氧化生成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，最后在正丙醇中用金属钠还原得到UDCA。这种方法步骤繁琐，操作安全性差，产品得率低，并且需要使用重金属氧化剂和催化剂，目前已被淘汰。

日本专利(JP 02282393)报道，在丁醇溶液中，氢氧化钠和钯碳存在的碱性条件下，于100℃，80kg/cm²的压力环境中，化学法催化7-KLCA的氢化反应，反应5h，UDCA的得率为88.2％。由于此方法需要在高压下反应，操作不便，没有投入实际应用。

2009年，Riva等报道了生物催化CA转化生成12-酮基-UDCA，进而利用化学法催化还原制备UDCA的方法(Adv Synth Catal,2009,351:1303-1311)。该生物转化反应中使用了三种酶，首先应用7α-羟基甾醇脱氢酶(7α-HSDH)和12α-羟基甾醇脱氢酶(12α-HSDH)催化CA氧化生成7,12-二酮基石胆酸，再利用7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH)催化7,12-二酮基石胆酸还原生成12-酮基熊脱氧胆酸。随后通过wolff-kishner化学还原反应生成UDCA。由于该酶法氧化还原过程中催化辅酶循环再生的酶专一性差，导致转化不完全，因此终产物UDCA的化学纯度不高。