[发明专利]7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在熊脱氧胆酸合成中的应用

权利要求书

1.一种活性及稳定性提高的7β-羟基甾醇脱氢酶，其特征在于，其是将如序列表中SEQID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的第57位甘氨酸、第128位甘氨酸、第163位异亮氨酸、第172位丙氨酸、第176位丝氨酸、第197位天冬酰胺、第200位甘氨酸、第243位天冬酰胺或第258位甘氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。

2.根据权利要求1所述的7β-羟基甾醇脱氢酶，其特征在于，所述7β-羟基甾醇脱氢酶具有如下序列：

(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替换为苏氨酸，第128位甘氨酸替换为丙氨酸，同时第200位甘氨酸替换为天冬酰胺；

(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替换为苏氨酸，第176位丝氨酸替换为丙氨酸，第258位甘氨酸替换为丙氨酸；

(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替换为苏氨酸，第172位丙氨酸替换为亮氨酸；

(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第128位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第163位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第163位异亮氨酸替换为缬氨酸，第172位丙氨酸替换为异亮氨酸，第243位天冬酰胺替换为色氨酸；

(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第128位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第197位天冬酰胺替换为苏氨酸，第258位甘氨酸替换为苏氨酸；

(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第172位丙氨酸替换为异亮氨酸，第197位天冬酰胺替换为酪氨酸；

(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第176位丝氨酸替换为亮氨酸，第200位甘氨酸替换为谷氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；

(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第197位天冬酰胺替换为酪氨酸，第258位甘氨酸替换为丙氨酸；

(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替换为苏氨酸，第176位丝氨酸替换为丙氨酸，第128位甘氨酸替换为甲硫氨酸，第197位天冬酰胺替换为苏氨酸，同时第258位甘氨酸替换为苏氨酸；

(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位甘氨酸替换为苏氨酸，第128位甘氨酸替换为丙氨酸，第172位丙氨酸替换为异亮氨酸，第197位天冬酰胺替换为酪氨酸，同时第200位甘氨酸替换为天冬酰胺；

(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第163位异亮氨酸替换为缬氨酸，第172位丙氨酸替换为异亮氨酸，第197位天冬酰胺替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为色氨酸。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1或2中任一项所述的7β-羟基甾醇脱氢酶。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的核酸。

5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如权利要求4所述的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主选择大肠杆菌或毕赤酵母。

7.一种重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂，其特征在于，所述的重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂是以下形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求6所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基甾醇脱氢酶的转化体细胞；

(2)培养如权利要求6所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基甾醇脱氢酶的粗酶液；

(3)对所述7β-羟基甾醇脱氢酶进行固定化，制备的固定化7β-羟基甾醇脱氢酶。

8.一种酶法转化制备熊脱氧胆酸的方法，其特征在于，使用如权利要求7所述的重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂催化7-羰基石胆酸的不对称还原反应，制备熊脱氧胆酸。