[发明专利]一种用于圆盘菌鉴定的标准基因及其应用

说明书

本发明涉及一种用于圆盘菌的标准基因序列及鉴定方法，属物种分子鉴定领域。所述标准检测线粒体mtLSU基因，基因序列SEQ ID NO.1。使用线粒体大亚基mtLSU基因通用引物ML7,ML8进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再用特异引物序列ML‑chaoF：AGAACAACGGCTAGGTGG，ML‑chaoR：GAACGAGTCCGCAGAAGA进行扩增，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后测序。根据mtLSU基因的序列差异，可以快速准确的鉴定圆盘菌。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，无需耗费大量的时间对其进行形态学鉴定，可以快速、准确的鉴定圆盘菌，为动植物线虫的防治提供有力的研究工具。

技术领域

本发明涉及物种分子鉴定领域，具体涉及一种用于圆盘菌分子鉴定的标准基因及其应用

背景技术

圆盘菌科（Orbiliaceae）是一种世界性广泛分布的小型盘菌，营腐生生活。在漫长的进化历史中，其菌丝体为适应生存环境，其菌丝体可变态为各种结构精巧的捕食器官捕食线虫，而且还能变态而重寄生其他植物病原真菌。另外，还能产生一些毒力因子，例如胞外酶包括丝氨酸蛋白酶、几丁质酶和胶原蛋白酶等直接或间接地参与侵染线虫体壁的过程。这类真菌是线虫种群自然控制的重要因子，也是植物病害生物防治的重要研究材料，在生物防治和适应性进化上具有极大研究潜力。目前该科真菌包含了几个重要的捕食线虫丝孢菌无性型属，如Arthrobotrys、Dactylellina、Drechslerella等。但因该科真菌包含无性型属种多，物种形态特征多样，某些物种间没有明显的显微结构差异，且目前对该类真菌的分子系统发育研究不足，分子证据和物种界定标准的缺乏，对其分类、科学命名和多样性研究造成了极大障碍。因此，急需标准基因来建立其快速的分子鉴定，通过形态研究和分子数据相结合的方法来解决其鉴别和分类问题。

发明内容

为克服形态学鉴定圆盘菌存在的不足，本发明提供了一种圆盘菌分子鉴定的标准基因序列及鉴定方法，可以快速准确地将该圆盘菌易混淆物种鉴定出来，从而为线虫的防治提供快速和有效的鉴定工具。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于圆盘菌分子鉴定的标准基因及其应用，包括mtLSU标准基因片段的建立和样品的鉴别步骤；其中：

（1）根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法，确保条带的纯度及可靠性。测序结果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的圆盘菌样品提取基因组DNA，利用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出样品的mtLSU基因，将扩增产物测序后分析比对，SEQ ID NO.1样本引物序列扩增样品的mtLSU基因序列片段作为标准基因。

（2）样品的鉴别：通过将待鉴别的样品序列与标准基因进行比对，基于同源性和基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种，获得序列间的相似性，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最近的对应物种即为待鉴别的物种；具体如下：

a. 基于同源性鉴定规则来鉴别物种

根据测序结果，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1核苷酸差异个数在10个以下，即可判断所述的待测样品为圆盘菌的某个物种。

b. 基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种

将标准基因序列和待鉴定的样品序列与圆盘菌的mtLSU基因序列合并应用MEGA或PAUP软件构建NJ系统发育树，检验未鉴定样品的DNA 条形码序列与标准基因序列聚类在一起的物种，若未知样品与数据库中的物种构成单支系，则鉴定为该物种。

本发明的优点在于：

1、优选mtLSU基因作为最适合鉴别圆盘菌的DNA条形码，相比于其他基因，mtLSU是线粒体基因，其序列具有通用、易比对的特点。