[发明专利]一种还原自组装蛋白质包裹磁性微球的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于材料领域，更具体地，涉及一种还原自组装蛋白质包裹磁性微球的制备方法及磁性免疫分析应用。

背景技术

超顺磁性氧化铁纳米粒(SPIO)是粒径在1～100nm之间的无机铁磁物质，因具有高的磁响应性、超顺磁性、较大的比表面积、易分离等独特的特征，现已被广泛应用于生物医学领域，例如生物传感器、细胞分选、组织工程、磁共振成像(MRI)、光学多通道成像、靶向药物运输、癌症的高热治疗和免疫分析等。

SPIO的合成方法主要有化学共沉淀法，热分解法，乳液合成法，水热合成法等，通过这些方式合成的裸的、未经修饰的SPIO不能直接在磁性免疫分析中进行应用。SPIO应用于磁性免疫分析的先决条件为长时间的稳定性，即无团聚或沉淀，未修饰的SPIO由于其巨大的表面能量和磁化强度使其变得非常容易聚集成团簇，而失去其单分散性及独有的性质；热分解法制备SPIO时，因反应过程中需要使用带有疏水长烷基链的酸、醇和胺等表面配体，所得到的产物均表现出疏水性，且粒径仅有10nm左右、磁分离困难，这些都限制了SPIO在磁性免疫分析中的应用。

可以通过使用包被材料对SPIO进行包裹制成磁性微球来解决这些问题。核壳结构的磁性微球可以对SPIO起保护作用，防止其被氧气氧化、被酸碱腐蚀、团聚；包被材料的包裹可实现油溶性SPIO的水溶性转换；制成的磁性微球中因含有多个SPIO，具有较强的磁性，大大改善了SPIO磁分离的速度；此外，包被材料的包裹还使SPIO带上一些活性功能基团(如-NH2、-COOH)，便于偶联抗体等生物活性物质，可以更好地在磁性免疫分析中进行应用。

生物大分子如蛋白质(人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白BSA、抗体、酶等)，属于天然高分子，具有很好的生物相容性，是很好的SPIO包裹材料。目前文献报导的制备蛋白质包裹的SPIO方法有热变性法，化学交联法，超声法和高压均质法。

通过水浴、微波等热变性的方式制备蛋白质包裹磁性微球是通过加热使蛋白质变性，暴露出疏水区域，以疏水相互作用、或者通过与蛋白质分子中的巯基结合，在SPIO表面形成包裹层(Food Hydrocolloids,2008,22:995-1005)。热变性法是制备蛋白质包裹磁性微球最简单的方法，但是该方法可控性差，在高温条件下，蛋白质聚集在SPIO的不同表面上，得到的产物粒径不均匀，分散性差且易造成SPIO包裹不完全。此外，热变性法会不可逆地改变蛋白质结构，导致其生物学特征的损失。

化学交联法是使用化学交联剂，如戊二醛、甲醛等，使蛋白质通过交联反应在SPIO表面形成包裹层(Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2013,436:1145-1151)。由于化学交联是非特异性的，存在于蛋白质质结构内的任何亲核基团(如胺和羟基)都有反应活性，导致非特异性吸附偏高；所得蛋白质包裹的磁性微粒的生物相容性差，残留的交联剂甲醛、戊二醛等醛类物质具有较大毒性。

蛋白质等是两亲性物质，亲水基团暴露在分子表面，疏水基团埋藏在分子内部。超声条件下，在油水混合体系中，会自发迁移到油水界面，自身的亲疏水基会起到类似表面活性剂的作用，降低两相间的界面张力，从而起到稳定乳化液的作用，能够使热分解油溶性SPIO在水溶液中分散开来(ACS Appl Mater Interfaces,2012,4:6479-6486)。超声法虽可实现对油溶性SPIO的蛋白质包裹，但是其和蛋白质的结合较弱，蛋白包裹层易在保存的过程中脱落、或者在盐溶解中解离下来。

高压均质法是使蛋白质在高剪切力的作用下产生气穴空化作用，从而引起了局部高热，生成了超氧化物离子，超氧化物离子氧化蛋白质自身带有的巯基、断裂蛋白质分子内的二硫键，暴露出疏水区域后，从而通过疏水作用、或者通过和巯基配位，在SPIO周围形成一个壳体(201610416623.6)。此过程需将SPIO和蛋白质一起泵入到高压均质机中进行均质，SPIO属于铁氧化物、刚性物质，具有很强的硬度，用高压均质机进行均质，对机器会有很严重的磨损；且该方法需要使用高压均质机这种昂贵、复杂的仪器设备，不易操作。

综上，现有技术用热变性法、化学交联法、超声法、高压均质法制备蛋白质包裹磁性微球均有缺陷，需要探索新的制备方式来解决这些问题。

发明内容