[发明专利]一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法

说明书

本发明提供了一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，分离来源丰富的人外周血CD4⁺T细胞，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将CD4⁺CD25^‑T细胞诱导并扩增成为高纯度、高调节效率的CD4⁺CD25⁺CD127^dim的抗原非特异性调节性T细胞。经过一个周期(6～7天)的诱导培养，即可获得足够治疗剂量的Treg，诱导的Treg表型和调节功能稳定，而且极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率，且质控方法特异快速，非常适合于临床应用。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法。

背景技术

细胞、组织或器官移植是治疗器官严重功能障碍或终末期功能衰竭的主要方案，在绝大多数情况下，器官捐献者(供者)与接受移植者(受者)是遗传背景不同的个体，因此，不可避免会发生急、慢性免疫排斥反应，而这正是影响移植治疗效果最主要的原因。介导免疫排斥反应的主体是受者体内的效应细胞，它们识别外来移植物抗原后活化、增殖并分泌大量效应分子，直接和/或间接地导致移植物损伤，目前，需要使用免疫抑制药物来控制效应细胞的功能，但是，长期服用免疫抑制药物会带来机会性感染、恶性肿瘤、心血管疾病、神经毒性等毒副作用，而且难以阻止慢性排斥导致的移植物功能丧失。因此，医学工作者正努力寻找新的抑制排斥反应的方法，以替代这些化学药物。大量实验研究表明，一类具有免疫负性调节功能的细胞能有效抑制效应细胞的功能，其中最重要的是调节性T细胞(Treg)。获得足够数量Treg的方法主要分两类，一类是分离出天然存在于机体内的Treg，然后在体外扩增，由于天然Treg的数量极少，需要进行多个周期的增殖培养(每6～7天为一个周期)，然而在此过程中，Treg的调节能力容易丢失；另一类方法是分离出机体内大量存在的静息T细胞(naive T细胞)，然后在体外利用抗原呈递细胞诱导培养出Treg，其只抑制能与供者抗原起作用的效应细胞，从而避免广泛的免疫抑制，尽管该类方法有众多的诱导方案，但几乎都受到诱导条件的限制，如一些抗原呈递细胞不易获取、价格昂贵、操作复杂、不符合临床标准等，而仅适合于实验研究，不利于临床开展。

发明内容

基于调节性T细胞(即Treg)的免疫细胞治疗具有良好的临床应用前景，如可能应用于治疗T细胞介导的自身免疫性疾病或应用到器官移植领域诱导免疫耐受。与抗原特异性Treg相比，抗原非特异性Treg应用适应症更广，但目前现有技术存在的最大问题是体外诱导调节性T细胞成本昂贵、耗时长、诱导效率较低、表型及调节作用不稳定等。本发明利用物极必反原理，采用文献从未报道过的全新方法，分离来源丰富的人外周血CD4⁺ T细胞，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将CD4⁺ CD25^-T细胞诱导并扩增成为高纯度、高调节效率的CD4⁺CD25⁺CD127^dim的抗原非特异性调节性T细胞。由于具有抗原非特异性，使其可能广泛应用于难治性T细胞介导的自身免疫性疾病。

本发明提供了一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：

S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC；

S2、去除非CD4⁺ T细胞，再去除CD25⁺ T细胞，从而得到CD4⁺CD25^-CD45RA⁺T细胞：