[发明专利]一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于，步骤包括：

S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC；

S2、去除非CD4⁺ T细胞，再去除CD25⁺ T细胞，从而得到CD4⁺CD25^-CD45RA⁺T细胞；

S3、将CD4⁺CD25^-CD45RA⁺ T细胞重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AIM-V CTS培养基，计数细胞总量，加入同等细胞数量的抗CD3/CD28磁珠、和终浓度为500～1000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～7天诱导结束，培养过程中每2～3天补加一次rhIL-2；

S4、磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，计数获得的活细胞量，取部分诱导后的T细胞进行表型和纯度的鉴定；

S5、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AIM-V CTS培养基，加入终浓度为50～200U/ml的rhIL-2，培养1～2天以静息诱导后的T细胞，分选活细胞；

S6、取部分步骤S5获得的活细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用含人血清白蛋白的生理盐水重悬。

2.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S6所述混合淋巴细胞培养为：以步骤S1所述PBMC为反应细胞，以不同个体的灭活PBMC为刺激细胞或者将抗CD3/CD28抗体作为刺激源，与步骤S5中所述分选的活细胞共同培养3～6天，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平。

3.如权利要求2所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：所述反应细胞与分选的活细胞添加量之比为1∶1～1∶0.125。

4.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S1所述外周血单个核细胞PBMC的分离方法为：向人外周血中加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。

5.权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S2所述得到CD4⁺CD25^-CD45RA⁺T细胞的方法为：将步骤S1所得PBMC先后与人初始T细胞分选试剂盒中的生物素标记的抗体复合物、亲和素磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除非CD4⁺T细胞，再与包被有抗CD25抗体的磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除CD25⁺ T细胞，从而得到CD4⁺CD25^-CD45RA⁺T细胞。

6.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S4所述表型和纯度的鉴定包括通过流式细胞术检测CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4、CD62L、CXCR3、CCR7、CD69、ICOS分子的表达。

7.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S6所述生理盐水含2％人血清白蛋白。