[发明专利]一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及的是一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法。

背景技术

腹泻是我国的常见病、多发病，感染的病原主要为病毒等，感染者从倦怠﹑乏力﹑低热等﹐甚至全身感染﹐脑﹑脊髓﹑心﹑肝等重要器官受损﹐可呈现不同的症状，预后较差﹐并可遗留后遗症或造成死亡。因此对腹泻病原体的快速、准确的诊断十分必要。同时腹泻病原体的种类繁多，给诊断带来巨大挑战。人星状病毒(Human Astrovirus，HAstV)是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷人群腹泻的重要病源之一，在全球范围内广泛存在，既可引起散发性腹泻，也可以引起暴发性腹泻。人腺病毒共有51个血清型，分属A～F 6个亚组。F组又分为腺病毒40型(Ad40)和41型(Ad41)，称为肠道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdV)。EAdV是引起全球婴幼儿急性重症腹泻的重要原因，被认为与幼儿园、学校和医院中散发腹泻和暴发腹泻有关。轮状病毒(Rotavirus，RV)是秋冬季婴幼儿腹泻最常见的病原，位居小儿腹泻第一位(约占40％)。根据病毒外壳抗原可分为A～G 7个不同的组，A组在流行学和疫苗方面最为重要。RV全球范围广泛存在。

目前，临床上常用的腹泻病原体检测方法为试纸条法(酶联免疫吸附法，ELISA)，此法虽然时间短，但是敏感性较低，且受到抗体动力学的影响。荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。

中国专利《多重PCR检测七种腹泻病毒用引物组和试剂盒及其检测方法》(文件号CN106191316；公开日2016年12月7日)公开了一种试剂盒及其检测方法，主要检测诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2、腺病毒、星状病毒和轮转病毒，根据专利文献所述，5种肠道病原体检测分为两个反应，反应一包括诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2和内对照；反应二包括腺病毒、星状病毒和轮状病毒。此专利实则进行两个三联检测。然而此专利没有添加内标，无法对样本核酸进行控制，另外，此专利将Cy5、FAM和YAK荧光素分别标记腺病毒、星状病毒和轮状病毒，而Cy5荧光素本身的荧光值较低，在低浓度时会造成荧光值太低被仪器认为是阴性，从而造成腺病毒的假阴性结果。

要成功实施多重PCR，需要解决几个技术问题：(1)由于每一种扩增子的最佳扩增条件都不一样，需要协调每个单独反应的条件以保证在单一扩增条件下各扩增子都能进行成功扩增。(2)由于需要使用多组引物/探针组合，不同引物/探针之间互相产生交联的可能性很大，因此在设计时需要考虑消除这一可能性。(3)每组引物/探针不能对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性的结果，影响对疾病的诊断。(4)需要有一定的方法来排除来自于核酸提取方面的问题，这就要求有内对照作为参考。

发明内容

本发明的目的是解决不同引物/探针之间互相产生交联的问题，提供了一种腹泻病毒检测引物和试剂盒及其检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒，试剂盒内设有阳性对照和阴性对照，其特征在于：该试剂盒内还设有用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体的多种引物组及探针序列的混合物。

优选的，用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3，荧光标记为ROX；

用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6，荧光标记为FAM；

用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO：9，荧光标记为HEX；

用于人内标基因检测的引物序列分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12，荧光标记为Cy5。