[发明专利]一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒，试剂盒内设有阳性对照和阴性对照，其特征在于：该试剂盒内还设有用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体的多种引物组及探针序列的混合物。

2.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒，其特征在于：用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3，荧光标记为ROX；

用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6，荧光标记为FAM；

用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO：9，荧光标记为HEX；

用于人内标基因检测的引物序列分别为SEQ ID NO：10和SEQID NO：11，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12，荧光标记为Cy5。

3.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR扩增试剂和对照试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR反应缓冲液、HAstV/EAdV/RV引物探针混合液和酶系，所述对照试剂包括阴性对照和HAstV/EAdV/RV阳性对照，所述阴性对照为细胞培养液，所述阳性对照为含HAstV、EAdV和RV目的基因片段的质粒菌。

4.根据权利要求3所述的一种多重PCR检测三种腹泻病毒用试剂盒，其特征在于：所述PCR反应缓冲液包括5×RT-PCR buffer和dNTPs，所述HAstV/EAdV/RV引物探针混合液为HAstV/EAdV/RV、内标引物和探针，所述酶系包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂。

5.三种腹泻病毒的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)按下列组成配制PCR反应液(n为反应管数)

PCR反应缓冲液1为16μl×n，HAstV/EAdV/RV引物探针混合液为2μl×n，酶系2为2μl×n；(注意：使用前确保PCR反应缓冲液、HAstV/EAdV/RV引物探针混合液充分溶解并混匀，酶系在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)

2)将反应体系按20μl/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区；

3)加样(在样本处理区进行)，用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有PCR反应液的PCR反应管中，盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区；

4)荧光定量PCR扩增(在扩增检测区进行)，将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤1)的引物的最终使用浓度为0.2uM，探针的最终使用浓度为0.1uM。

7.根据权利要求5或6任意所述的检测方法，其特征在于：步骤4)的反应条件包括如下a-g的程序：

a：50℃保持25min(逆转录)；

b：95℃保持5min(热启动)；

c：95℃维持10s(变性)；

d：55℃维持15s(退火)；

e：72℃维持30s(延伸)，进行5个循环(预扩增)；

f：95℃维持10s(变性)；

g：60℃维持45s(退火/延伸，采集荧光信号)，进行40个循环。