[发明专利]肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物治疗与生物医药领域，特别涉及一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途。

背景技术

水蛭素是迄今发现的活性最强的天然凝血酶特异性抑制剂，最初从医用水蛭唾液腺中分离得到，由65～66个氨基酸组成，可直接与凝血酶以l：l(摩尔比)的方式结合形成非共价复合物，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十种以上变体，主要有简称为HV1、HV2、HV3三种同源性很高的异构体(Hirudin Variant)。

目前，国外已有两个重组水蛭素产品被批准上市：1.Desirudin(商品名：Revasc，瑞士Novartis产品)，2.Lepirudin(商品名：Refludan，英国Pharmion及美国BerlexLaboratories产品)。两者结构上仅在N-端存在微小差异，Desirudin为Val1-Val2，而Lepirudin为Leu1-Tyr2。Desirudin用于手术时深度静脉血栓(DVT)的预防与治疗，Lepirudin用于肝素诱导的血小板减少性疾病患者的抗凝治疗。此外，水蛭素在防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑血栓、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具有巨大的潜在临床应用价值。

在多种恶性肿瘤患者中存在着血液高凝状态，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。恶性肿瘤患者血液中的高凝状态，不仅能促进体内血栓形成，而且与肿瘤生长、侵袭以及转移明显相关。凝血功能变化可引起肿瘤细胞表型和活性改变，促进肿瘤细胞与血小板、内皮细胞、纤维结合蛋白(Fibrinectin)以及Von Willebrand factor(vWF)的黏附，从而使肿瘤细胞在局部增殖、浸润甚至向其他部位转移。血栓性疾病是仅次于肿瘤转移的恶性肿瘤患者第二大致死因素。对血栓形成高危肿瘤患者及早进行药物性干预，对于延长患者生存期、降低死亡率有重要意义。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。重组水蛭素通过其抗凝作用，抑制纤维蛋白的形成，能防止肿瘤细胞与血纤维蛋白或血小板凝集，使NK细胞或其他细胞毒效应细胞的活性得以发挥。已证明水蛭素治疗可发挥疗效的肿瘤有纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化疗和放疗，通过促进肿瘤中的血流、改善乏氧状态而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，半致死剂量远大于治疗所需剂量，机体易接受，免疫性弱，不影响血小板、纤维蛋白原水平和血红蛋白含量，不易通过血脑脊液屏障。无论急性、亚急性的毒性试验，水蛭素对呼吸、血压、心率均不影响。水蛭素在体内无降解，以活性成分经肾脏排泄。

水蛭素作为一种高效、直接、特异的凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗血栓以及抗炎等多种药理活性。与肝素等传统的抗凝药物相比，其治疗剂量小、疗效高、不会引起过敏反应。水蛭素有抗原性，但其抗体没有害，反而延长消除半衰期，是一种少见的正效果抗体。因此水蛭素的应用将会不断得到开拓和推广，重组水蛭素将会成为新一代的抗凝、抗栓和抗肿瘤新药。但是，水蛭素又可导致凝血相关参数，如活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT)等明显升高，从而可能引起全身或系统性出血风险。临床上，作为一个理想的抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明确的抗凝、抗栓效果，但又不引起出血副作用，尤其是在以治疗肿瘤为目的的临床应用时，其理想的工作状态为靶向性的在肿瘤局部发挥抗凝、抗栓、抗肿瘤作用，从而使临床用药安全性提高。在肿瘤治疗领域，如何进一步减少水蛭素的副作用，增加其肿瘤治疗靶向性是值得探讨的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤特异性重组水蛭素及表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞，至少能够解决上述问题之一。

本发明思想的指导原则的关键是构建水蛭素衍生物，使水蛭素抗凝活性进行肿瘤靶向性释放，即在正常条件下，该水蛭素衍生物无抗凝活性，而当位于肿瘤位置时，该水蛭素衍生物的抗凝活性才在肿瘤局部释放，营造不易形成血栓的微环境，甚至溶解已形成的微小栓子以达到抗凝、溶栓、防止肿瘤细胞转移的功能。这就克服了野生型水蛭素全身用药引起系统性出血的风险。