[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因编码技术领域，具体涉及使用CRISPR/Cas9基因编码技术构建MARF1定点突变小鼠模型的方法和应用。

背景技术

MRAF1蛋白简介

苏等最近发现了一个编码过去功能未知的全新蛋白的Riken基因(4921513D23Rik)。携带该基因单位点突变和基因陷阱(gene trap)突变的小鼠均表现出同样的雌性不育而雄性正常的表性。进一步研究表明，导致雌性不育的直接原因是雌鼠卵母细胞不能恢复减数分裂而排出未成熟的卵母细胞。据此，我们将该基因命名为Marf1(meiosis arrest female 1)。在临床上，MARF1蛋白也具有重要的意义。在我们实验的基础上，陈子江等曾对卵子成熟障碍患者基因的关键外显子进行测序，探讨人类卵子成熟障碍是否与MARF1基因变异相关。

MARF1是一个RNA结合蛋白，除了拥有该类蛋白一般具有的RRM(RNA recognition motif)外，它在N-端拥有1个类似核糖核酸酶(RNase)的结构域(domain)，在C-端拥有1个新被发现的、被命名为OST(oskar,tudor)或LOTUS(limkain,oskar and tudor domain containing proteins 5 and 7)的结构域。OST/LOTUS结构域也存在于果蝇蛋白Oskar和哺乳动物蛋白TDRD5和7(tudor domaincontaining proteins 5 and 7)中，并且被推测能够结合双链RNA特别是那些经与piRNA杂交后而形成的双链RNA，然后把它们携带到生殖细胞内诸如nuage或germ granule的特定部位。Oskar和TDRD5,7分别在果蝇生殖细胞决定(germ cell specification)和小鼠雄性生殖细胞减数分裂及反转座子沉默中起重要作用(Su.et.al.PNAS.2012)。具体见图1。

MARF1蛋白定点突变

在蛋白质结构数据库NCBI-Structure(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)进行保守的蛋白结构域类比，比较了NYN和同样保守的XNI，5’-EXONUCLEASE，TAQ DNA POLYMERASE，RIBONUCLEASE H，发现它们拥有4个保守的Asp核酸酶催化残基。在MARF1蛋白的NYN依次对应为D178，D215，D246，D272。在蛋白结构研究中，丙氨酸是氨基酸中侧链最短的手性氨基酸。通过将某氨基酸残基突变为丙氨酸，可以通过考察该突变蛋白的功能是否因此突变而失去或改变，从而可以定位对该蛋白功能有关键影响的氨基酸残基。置换成丙氨酸，去除了侧链上的活性基团，换成了体积小、无其他官能团的甲基，同时对蛋白质结构的影响较小。因此，本发明选择了突变272号位点，将天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)。MARF1的272号天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)后，可以用于具体研究MARF1的NYN结构域失活之后对整个MARF1蛋白的影响，进一步细致的研究MARF1蛋白丧失NYN酶活性后，对卵母细胞转录后mRNA稳态调节的影响。具体序列比较见图2。

CRISPR/Cas9系统简介